形質転換について

乳酸菌から抽出した５ＫｂのプラスミドとpUC19ベクターをXba1で消化後、ライゲーションしてE.coli5αにエレクトロポレーションしてIPTG,X-Gal含有LBプレート上で白色のコロニーが出現しました。そのコロニーを培養してプラスミドの抽出を行い、Xba１で消化すると２本のバンドが確認されたのですが、再び培養後に抽出を行い、電気泳動を行うとpUC19のバンドしか確認されませんでした。これはどういうことなのでしょうか？組み込まれたインサート部分が形質転換後にベクターから脱落することってあるんでしょうか？

No.2 回答者： knightgold 回答日時： 2001/07/17 19:48

　昔自分も同じようなことがありました。

コロニーから拾うものはかなりの高さで遺伝子の確認が出来ましたが、培養を重ねていくと脱落するのかは分からないですが、確かにバンドが見えなくなっていました。
　考え方ですが、コロニーから拾ったときに全てが形質転換したものではないはずですから、それを拾っている可能性があります。下記の方が話されているように、
大きな系で行うと、形質転換していないものも増殖している可能性はあると思いますし、脱落も考え難いですが、遺伝子の長さが大きいと、やはり菌には負担が掛かるので、脱落も考えられると思います。（あくまでも持論です）　
　培養に、抗生物質をつかってスクリーニングされているようでしたら、自分の考え難いと思います。

　上手く培養して行く方法としては、大きい系で行ったら、再度スクリーニングを行う為、固形培地に戻し、白色コロニーを拾う様にして、培養を続ける事が出来ると思います。固形培地も冷蔵庫で冷やしていますが、長くは持たないので、定期的に移植して行くと、形質転換体を保持できると思います。
　その前に、-70℃などのフリーザーで凍結保存させた方が良いと思いますが。（多分、分かって見えますよね）
　次の段階に移る場合は、移植を重ねたものでは無くて、凍結していたものからコロニーを作ってその系から行ったほうが、菌も新鮮で、リスクが少なくなりますから、こちらもお勧めします。
　（既に分かっている事でしたら失礼します）

この回答へのお礼

大変参考になりました。やっぱり、大きいと脱落しやすいんですね。また形質転換は行う予定ですので、アドバイスを参考にさせていただきたいと思います。ありがとうございました。

お礼日時：2001/07/19 18:15

No.1 回答者： m_nkgw 回答日時： 2001/07/10 18:18

insureさんの増幅されているDNAがどのようなものであるか、培養条件、保存条件はどうであるかによって、脱落であるかどうかは変わってきますが、Small Scaleで培養に成功してもLarge Scaleでは脱落してしまうこともありました。

また、Large Scaleにしたとたん、Insertがどんどん目減りしていって、必要な長さに満たなくなってしまうこともありました。配列によってはベクターを変更したり宿主を変更したりして防ぐことができましたが、それでも脱落してしまう配列もありました。

再実験をしても脱落するのなら。培養条件の見直し、ベクター、宿主の再検討を一度されてはどうですか？