PCR断片をインサートとするクローニング

以前にも何度かこちらで質問させていただいているのですが、PCR断片に制限酵素サイトをくっつけたものをインサートとしてクローニングを行おうとしているのですが、プライマー設計の際に、何塩基ほど余分な塩基をつけたしていらっしゃるのでしょうか？
自分はこれだけ付加してうまくいっているという方、どうぞ教えてください。

乱文につき意味を図りかねましたらばんばん補足要求してください。
よろしくお願いいたします。

No.1 ベストアンサー 回答者： geneticist12 回答日時： 2005/05/23 13:49

酵素によって、DNA末端の認識部位を安定して認識させるのに必要な塩基数は違うのですが、たいていは最低２塩基余分にあれば十分です。

ものによっては、５から７塩基くらい必要なものもあります。
NEBのカタログのAppendixにそれに関する情報がでています。たとえば、EcoRI、BamHIなんかは、１塩基あれば、ほぼ100％の効率で消化、HindIIIだと、１塩基では0%、2から3塩基で90％だそうです（注意書きとして、これは制限酵素でクローニングサイトを切って作った末端で調べていて、一本鎖の突出末端部分は考えに入れていない、しかしこれが認識効率に影響がないかどうかはわからないので、PCRプライマーを切断するときは、さらにプラス４塩基（突出末端分）余分にデザインすることを勧める、なんてことも書いてありますが）。。

この回答へのお礼

詳しい説明ありがとうございました。TAクローニングをおこなったところ、簡単に導入・切断できました。

お礼日時：2005/06/01 17:53

No.2 回答者： meineko 回答日時： 2005/05/23 14:56

わたしは、1塩基余分につけてということが多いのですが、これで、うまく切れない様に思われたときは、いったん、TAクローニングしてから、制限酵素で切る様にしています。

この回答へのお礼

TAクローニングを介しておこなったところうそみたいにうまくいきました。ありがとうございました。

お礼日時：2005/06/01 17:55