HepG2の継代について 凝集しないようにするには？

卒業研究の実験で、ヒト肝ガン由来細胞株HepG2を扱うことになり、最近培養のトレーニングを始めました。
しかし、継代する際にトリプシンで剥がすと、どうしても凝集してしまい、新しいdishに播いても凝集した細胞が目立ちます。今自分がやっている操作は下の通りです。

100mm dishに１×10の5乗 cells/ml　で播き込み、
培養4日目に培地を捨ててPBSで洗浄し、
トリプシン液1mlを加えて3～5分間インキュベートし（このとき1分毎に顕微鏡で観察しています）、
培地を加えて剥がし、ピペッティングして細胞数を計測、
遠心して培地を捨て、新しい培地で希釈して、dishに播いています。
ちなみに培地は低グルコース濃度のDME培地（serum +)です。

実験では、培地に食品成分を添加し、細胞の脂質合成へ与える影響を調べるのですが、凝集したままの細胞を使用すると細胞が十分に食品成分を取り込めないのではないのか、という不安があります。
そのため、細胞をばらばらにするためにしっかりピペッティングしたりしていますが、時間がかかるために培地の色が赤紫に近くなってしまい、細胞に対するダメージがかなり心配です。

細胞が凝集しないように継代する方法はありますか？

それとも、私が凝集させてしまうのは、単に技術的な問題でしょうか？慣れてくればバラバラにできるようになるのでしょうか？

どなたか、経験のある方、教えてください！

No.1 ベストアンサー 回答者： takumicchi 回答日時： 2005/07/31 04:50

結論から言って技術不足です。

継代の仕方事態にそれほど問題はなさそうですが、トリプシン処理中の操作とハーベストの時に問題がありそうです。

トリプシン処理中に1分ごとに観察しているとありますが、その時の操作は慎重にトリプシン液を大きく揺らさないようにしていますか？液が揺れると特にディッシュの周りから細胞がシート状にはがれて凝集しやすくなります。

細胞をハーベストする時は勢いよく一気にメディウムをかけます。フラスコではなくディッシュなのでメディウムが飛び出さない程度に強さ加減してください。ピペッティングも細胞にダメージを与えるので極力少なくしいます。私の場合はハーベスト時のピペッテティングは３回以内です。

ちなみに完全にバラバラにするのは細胞にとってあまりよくありません３～５個の塊が均一にあるのがベストです。


培養細胞をやれる環境にあるということは当然先輩たちもやっているはずですね。まずは先輩たちに聞いて、自分がやっている様子をみてもらってアドバイスをもらうことです。ここで、文章で読んでできるなら、既にできているはずですから。HepG2は凝集しやすいですが練習で改善できるでしょう。ディッシュを増やして毎日、数枚継代できる状態を作りましょう。


頑張ってください。

この回答へのお礼

丁寧なお返事をありがとうございました！
トリプシン処理のときは、揺らしたり、物理的刺激を与えないように気を使っています。タッピングもしていません。
細胞を完全にバラバラにするのは良くないのですね。初めて知りました。今まで、一個一個にしようとやっきになっていました…。
技術不足、ということは練習していけば改善できる話なので、少し安心しました。
実は、今まで私の研究室ではラット初代肝細胞培養の経験はありましたが、HepG2を扱うのは今回が初めてで、最初は取り扱いを他の研究室の先生に教わりました。しかしこの先生も忙しくて、つきっきりで見てもらうわけにも行かず、一人でトレーニングをしていました…。
他の研究室の人にも頼めば教えてもらえると思うので、ずうずうしく教えてもらいに行くことにします。
どうもありがとうございました！

お礼日時：2005/08/01 00:44

No.2 回答者： komii 回答日時： 2005/07/31 12:34

私は、他の細胞しか扱ったことがないのですが私がやっている方法を紹介します。

凝集は何度か経験したことがあります。
PBS処理後(トリプシンが効きにくい場合にはPBSで2回洗っています。)トリプシンを2ml(培養液の1/10量くらい)面に染ませた後、少量残して、デカントまたはアスピレーターで吸って捨てます。(理論上この量で剥げるというのと実際は違うなということを思ったので)インキュベート中は観察はしないで、だいたいこのくらいだろうというカンでインキュベートしています。剥がれ難い細胞は2分半～3分、剥がれやすい細胞は2くらいインキュベーとしていると思います。
インキュベートしている間に新しい培養液に血清やTPBを加えてていたりするので、結構いい加減です。
トリプシン処理をしすぎると、細胞が消化されてダメージを受けるので避けた方がいいいと思います。
その後、培養瓶を軽く叩いてからバラバラにします。
この時、塊があったら、なるべく泡立てないにピペッティングします。
ピペッティング中に培養液の色が変わったことがないので色が変わるということが理解できないのですが、ピペッティングは最大でも5回くらいしかしません。
pHの変動は、細胞にストレスを与えるのでできるだけ避けた方がいいと思います。
あまり上手にいかないようなから、新しい細胞を出してくるのもいいかもしれません。
とりあえず、私は過去に先生に指示を仰いだ時、凝集に対しては、ピペッティングを良くして下さいということを言われました。
慣れてくるとできると思うのですが、上級生に相談して指示をもらってみて下さい。

この回答へのお礼

丁寧なお返事、どうもありがとうございました！
インキュベートの時間は、最初は参考書を見て５分おいていましたが、日によってトリプシンの効きが良かったり悪かったりするので、３分経ったら１分ごとに顕微鏡で観察する方法に切り替えたところでした。（経験不足なので不安で…）トリプシン液を少量残して吸い取る、という方法も試してみようと思います。
剥がすときもピペッティングするときも、泡を立てないように気をつかってはいるのですがどうしても泡ができてしまったりします…これも経験不足のせいだと思います…。
培養液の色が変わる＝操作に時間がかかりすぎている、ということだと思います（ピペッティングを念入りにしすぎかと…）。pHの変動はやはり良くないですね。気をつけます。
私の研究室にはHepG2を扱った経験のある人がいないので、他の研究室の人に教えてもらいに行こうと思います。
どうもありがとうございました！

お礼日時：2005/08/01 00:56