No.3ベストアンサー
- 回答日時:
以前扱っていた膜タンパクを可溶化した時には、Nonidet P-40とsodium deoxycholateが入ったバッファーを使いました。
バンドが検出されないとの事ですので、目的のタンパク質自体が分解されている可能性があります。私はバッファーにプロテアーゼ阻害剤を添加し、細胞を回収する操作はすべて氷上で行い、回収したlysateは液体窒素で急速凍結してから-80℃で保存していました。このlysateと*3サンプルバッファーとを2:1で混合し、加熱処理した後に電気泳動します。参考サイトの文献ではHEK293に対して同じような組成のバッファーが使われています。
Westernの検出はHRP標識の二次抗体を使ってECL法で行いました。ECLは検出までに時間が掛からず、感度が良いのでお勧めです。
参考URL:http://www.jbc.org/cgi/content/full/277/8/6590
No.2
- 回答日時:
差し支えなければ、下記の点について補足をお願いいたします。
・どのような細胞をお使いですか?
・lysisに使用してうまくいかなかった界面活性剤は?
・Westernの検出方法は?(二次抗体など)
・陽性対照として他の膜タンパクの抗体で検出された事はありますか?
この回答への補足
細胞はHEK293で、受容体をトランスフェクトしました。
lysisに使用した界面活性剤は0.1%SDSと1%triton-Xです。検出法は1次抗体がマウスのモノクロで2次抗体がウサギのanti-マウスIgG抗体です。
対照はおいてません。融解法はシリンジで30回ほどピッペッティングしてそのまま2*サンプルバッファーとまぜてます。膜タンパクを扱うのが初めてなもので、、、
お探しのQ&Aが見つからない時は、教えて!gooで質問しましょう!
似たような質問が見つかりました
- 薬学 脂溶性ホルモンと水溶性ホルモンの作用機序の違いを2つあげなければならないのですが、わかる方はいますか 1 2023/01/15 21:44
- 経済 今年7月から。 ゼロゼロ融資 コロナ倒産=従業員を救う為の保証人なし担保なしの融資の回収が7月から 3 2023/08/13 08:08
- 生物学 細胞死について 細胞内の組織の分解が、その同じ組織の構築と修復と同様に能動的な生体現象であるのなら、 1 2023/04/01 20:03
- 医学 活動電位について 1 2022/10/14 13:12
- 生物学 浸透圧の問題 3 2023/06/08 16:57
- メガネ・コンタクト・視力矯正 視力回復 3 2022/06/22 20:47
- 化学 呼び塩と浸透圧の関係が分かりません。教えてください。 2 2022/07/05 08:42
- 銀行・ネットバンキング・信用金庫 大金受け取りのメール、、良く大金受け取りのメール、銀行口座番号を教えてと、来ます、、今は都市銀行に、 6 2022/06/04 01:06
- 不妊 4/18の段階で卵胞が14mm、 4/22に再受診し、14mmまで育った卵胞が見当たらず内膜が10m 1 2022/04/25 13:03
- その他(IT・Webサービス) ペイペイフリマ 1 2023/06/17 20:19
おすすめ情報
デイリーランキングこのカテゴリの人気デイリーQ&Aランキング
-
抗体価って何ですか?
-
pan-カドヘリンとは?
-
イディオタイプとは
-
IBとWBの違いは?
-
高校1年の化学です! 今、抗原...
-
ウエスタンブロット 発色の原...
-
免疫染色やウエスタンブロットで
-
糖鎖に対する抗体
-
アジ化ナトリウム
-
ウェスタンブロットのサンプル...
-
ImageJを用いて免疫染色陽性率...
-
要らない培地の廃棄法
-
オートクレーブ121℃15分の意味
-
ピーナツのこのカビはアフラト...
-
食品細菌検査での希釈水につい...
-
最小培地か最少培地か?
-
PBSとTBSの使い分けについて
-
バキュームカーって菌を撒き散...
-
カナマイシンとx-galの入ったLB...
-
嫌気培養におけるレサズリンの役割
マンスリーランキングこのカテゴリの人気マンスリーQ&Aランキング
-
IBとWBの違いは?
-
ウェスタンブロットのサンプル...
-
バルク溶液
-
ウェスタンブロットについて質...
-
1次抗体で有名なメーカーを教え...
-
抗体価って何ですか?
-
高校1年の化学です! 今、抗原...
-
ブロッキングって必要なのでし...
-
抗体で、isotype controle とは...
-
Rh血液型のDuを調べています
-
血清で非特異反応がブロックで...
-
Rh-の血液はRh+の人に輸血でき...
-
pan-ERKとは何でしょうか?
-
抗体の免疫動物と交差性について
-
Western Blot法の長所と短所を...
-
抗体の保存方法について
-
蛍光免疫染色封入時のパップペ...
-
ウェスタンブロットについて
-
フローサイトメトリーのネガテ...
-
ウエスタンブロットで二次抗体...
おすすめ情報