ライゲーション、形質転換がうまくいきません

以前1629941で制限酵素処理について質問させていただいたものです。その後
約3kbpのpBluescript II sk (+)のmcsをEcoR1,Xho1で切断し、EcoR1,Xho1で切断した約1.6 kbp「プロモーター＋ネオマイシン耐性遺伝子＋polyA」断片を挿入したいのですが、全くコロニーができません。（LB培地＋Ampにて）（ベクター、インサートともにゲル抜きしその後フェノール抽出した）
ライゲーションの系はSDW：4.4マイクロリットル
10×T4buffer：1マイクロリットル
10ｍMdATP：１マイクロリットル
インサート（190ナノグラム/マイクロリットル）：1.6マイクロリットル
ベクター（182ナノグラム/マイクロリットル）：1マイクロリットル
T4リガーゼ：1マイクロリットル
もうひとつの系はインサート2マイクロリットル（SDWは4マイクロリットル）
16℃で14時間
そのライゲーション産物10マイクロリットルを100マイクロリットルのコンピテントセルに入れました。
pBluescript II sk (+)をコンピテントセルに入れる技術はあります。
制限酵素処理後、形質転換までに他にすべき操作があるのか?
根本的にどこか間違っているのか?
やり直すとしたらどこからやり直すべきなのか?
教えてください。
今回使用した酵素、buffer全て新しく購入したものです。
よろしくお願いします。

No.5 回答者： umeru 回答日時： 2005/09/30 17:58

根本的な話なんですが、テンプレートおよびインサートDNAの抽出法はなんでしょうか。

私も以前、ライゲーションでノーコロニーの状態が続いて、困ったことがあります。

当時はアルカリSDS法でDNAを抽出していたのですが、
アルカリSDS法ではRNAの除去が不十分で（RNase＋エタ沈操作を入れても）、RNAがライゲーション反応を阻害？？していたようです。
・RNAは制限酵素によってバラバラに切断され、ライゲー　ション時にDNAの切り口とライゲーションしてしま　　う。
・またDNAの吸光度で波長を示すので、吸光度計でDNA　濃度を測定しても、正しい濃度が測定できない
といった、弊害があります。

もしDNA精製法によってRNAの混入が考えられるのでしたら、BIORADやQIAGENのDNA精製KITを使用するか、ミニプレ後のPEG沈によってRNAを除去することをお勧めします。私の場合、BIORADのミニプレKITを使用することで、その後の操作がかなりラフ（ゲル抽出後そのままライゲーションしたり、ライゲーションのテンプレートとインサート量なんて考えない等）でもライゲーションできるようになりました。

No.4 回答者： yumi31 回答日時： 2005/09/25 19:04

インサートのDNA量（約304ng)に対してベクターのDNA量（約182ng）は多いのではないでしょうか？インサート：ベクター＝2~3:1がベストかと思います。

また、ligaseは失活させてますか？

私もやり直すのであればベクターおよびインサートの再精製からやり直すことをお薦めします。

No.3 回答者： MIYD 回答日時： 2005/09/25 18:13

ベクターを182ngも入れているのに片方でしか切れていない切れ残りのベクターのセルフライゲーションが全くないのならばライゲーションの条件がおかしいのではないでしょうか。

ATPの失活の可能性はありませんか。

ゲル抽出キットを使うことは出来ないのですか。
前に自分で低融点アガロースでフェノール抽出した時にはコロニーがぜんぜんでなくて、その精製物をさらにPCR精製用のカラムにかけて精製したら二桁以上コロニーが増えたということがあります。

フェノール抽出後にフェノールが残っているということはありませんか、
クロロホルム/イソアミルアルコールでの抽出(フェノールの除去)を後で行っていますか。

またはフェノール抽出後のエタ沈で(やっていますよね)
ちゃんと70%エタノールでリンスしていますか。
塩が残っていると反応しません。

ゲルの切り出しの技術はあるのですか。
いままでに同じ方法でとってライゲーションできたことはあるのでしょうか。


また、本当にインサートはEcoRI,XhoIで切れているのでしょうか、
(コンストラクション時に制限酵素サイトが出来ていたりしないのでしょうか)
片方で切っても1.6kbのものが出来たりしないのでしょうか。　


わざわざネオマイシン耐性遺伝子と書いてあるということはプロモーターは真核生物用ですよね。
LacZ用のプロモーターと向きが合っているのならばやってみてもいいかもしれませんが、
疑陽性のコロニーがたくさん出てくるというのでもない限り試す意味がないかと思います。

やり直すとしたらインサートの元のベクターの制限酵素地図の確認からでしょうか。

No.2 回答者： joyjoyjo 回答日時： 2005/09/25 01:52

クローニングしたい断片に「ネオマイシン耐性遺伝子」があるので、大腸菌ではカナマイシンで選別が可能かと思います。

カナマイシンによる選別をしてみてはどうでしょうか？
そうすれば、少なくともベクターのゲルの切り出しはしなくてすむかと思います。
あと、ライゲーション時にクローニング断片の量をもう少し上げた方がいいかとも思います（大きさにもよりますが、通常mol比で２倍以上。ですがうまく行かない場合はそれよりも上げていくと経験的にくまくいくことが多いです）。

>やり直すとしたらどこからやり直すべきなのか?
教えてください。

持論ですが、ライゲーションで訳のわからない失敗をした時は、plasmid精製からやり直した方がいいかと思います

No.1 回答者： geneticist12 回答日時： 2005/09/24 23:16

ゲルから切り出すときにUVを当てすぎではないですか。

http://oshiete1.goo.ne.jp/kotaeru.php3?q=1399818