質問

プラスミドのTE(pH8)に対する溶解度は高いんですか?

エタ沈後、エタノールを除去するとプラスミドの沈殿が残りますが、
これをTEに溶かすことがあるんですが、どのようにして溶かしたら
いいんですか?
溶解度が高いんならほっとけばいいと思いますが。
エタ沈はWAKOのエタ沈メイトというキットを使っています。

また、大量のエタノールを入れて精製した場合、チューブの壁面に沈殿が付くと思いますが、沈殿後に加えるTEの液料が少ない場合は液に接しない壁面の沈殿はどうやって溶かせばいいですか?
ピペットで落とすしかないんでしょうか?

また、完全に溶解したかどうかはどうやったら確認できますか?
透明になっていれば溶解したということになるんでしょうが。
沈殿自体が見えにくいのでなかなか苦労しています。

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回答 (5件)

少し裏技をしょうかいしましょう。70%エタチン後70%エタノールを除いてこんど100-95%エタノールを加え遠心してみてください。もういちどエタノールを除き風乾すると乾きやすいです。真空乾燥までする必要はなく、もしするとしたら37度の大腸菌のインキュベーターにでも掘り込んで10分くらいおいとけば大丈夫です。

この回答への補足

37℃に10分入れると乾燥させすぎてまずくないですか?

7エタチン後、上清を取り除いてエタノールで再度遠心するのってめんどくないですか?

乾燥させすぎて解けにくくなるなら
乾燥させない方がいいかもしれないですね。
ピペッティングで丁寧に除去して室温で3分くらい乾燥させたらいいかもしれないですね。

真空乾燥は今ではあまり使わないみたいですね。

ピペットで上手に吸い出すか、ピペットチップをつけたアスピレータで吸い取れば、室温で30分、37℃で5~10分もやれば十分です。チューブの底を指でつまんでしばらく体温で温めるだけでも良いくらいです。逆にそれくらいでアルコールが飛ぶくらいにきれいに上清を吸い取っておかなければ、塩などの不純物もたっぷり残っているわけで。

ちょっと湿っていてもアルコール分は十分に飛んでいますし、少々アルコール分が残っていたとしても、TEに溶かせば後の酵素反応に問題ないくらい希釈されます。

いまだに真空乾燥しているというのは、時代遅れと言って良いと思います(Molecular Cloningの前の版でもすでに、避けるべきと書いてあったような、、、)。

この回答への補足

シークエンス反応後の70%エタチン後、上清を取り除いて真空乾燥させています。真空乾燥後、シークエンス溶液Hi-Di formamideに溶解しています。

プラスミド自体の溶解度は悪くありません。
また、よっぽど大量でなければ、沈殿は透明でほとんど見えません。見えているとしたら不純物のためです。たまに、全然溶けない沈殿が残ることがありますが、プラスミド自体は上清にちゃんと溶けていています。

ただし、操作によって非常に溶けにくくなることがあります。
1.むかしは真空乾燥をするのが普通でしたが、これはDNAを溶けにくくさせるうえ、変性させるという報告もあるので、やめたほうが良いといわれています。実際、アイソトープラベルしたDNAを真空乾燥させると、溶液中に回収できずチューブに残る放射活性が非常に高いことがわかります。室温で放置、または37度くらいで穏やかに温めて乾燥させるのがいいです。

2.Mg++が存在するとDNAが非常に溶けにくい塩を作って溶けにくくなります(逆にこれを利用してEtOH沈殿の回収率を高める方法もあります)。これは純水に溶かそうとするときには難儀ですが、TEに溶かすのであればキレートされるのでそれほど問題ではありません。

沈殿を少量の溶媒に溶かすときには、タッピング(チューブの底をはじく)で、溶媒が十分な範囲をなめるようにすると良いでしょう。チューブの性質にもよりますが、沈殿が付いているところは、水はじきが悪くて液が残ります。壁に付いた液が軽くはじいただけできれいに取れるようになったら、溶けていると溶けたと思っていいでしょう。
また、おおよそ10 kb以下の小さなプラスミドならVortexを使ってもかまいません。

この回答への補足

真空乾燥するようにいわれましたが、
やりすぎると溶けにくくなるようですね。
エタノール沈殿にやるんですが、ある程度は真空乾燥しないと
エタノールが残ってしまうんじゃないでしょうか。
残っていると問題がありそうですが。
ピペッティングで完全に取り除くことができればいいんですが、
37℃、室温ですぐに乾燥するものなんでしょうか。

非常にきれいなDNAは完全に風乾しても、すぐに解けてくれると思います。しかし大抵はそこまできれいじゃなかったりするのでしばしばかわかしすぎることで解けなくなることがあるようです。沈澱がかろうじてでも見れるようであれば、解けない時は、溶かした時それがぼうじゅんしてきて、透明または半透明なゲル状のものができます。溶液にそのようなものが見えなければ解けていると考えていいでしょう。

エタちん後、70%EtOHであらい、遠心してから70%EtOHを除く時にピペットで完全にとり、すぐに溶かすのが理想的です。そこが幾らか平らな部分があるチューブだとそれがやりやすいです。

>大量のエタノールを入れて精製した場合、チューブの壁面に沈殿が付く

ということですが、これも純度などでいくらかちがってきます。エタノールを加えた後5分ぐらい放置すると、より大きいDNAの凝縮が望めますのでそこに落ちてくる可能性が高くなります。

答えになっているかわかりませんが、

最後に沈殿したDNAのペレットの状態で、解けやすさが変わります。

エタノールを除いた状態で、ペレットは白いと思いますが、これを風乾すると、だんだん半透明になってきます。さらに乾かすと、また白くなります。
 半透明の状態が、一番解けやすいです。
 乾燥が足りなかったり、乾かしすぎたりすると、溶けにくくなります。
 例えば、100mlの大腸菌のカルチャーで、キアゲンのMAXIで調整したペレットなら5分から10分、15分くらいで、半透明になります。最初は、ずっと見ていてください。TE量は、0.2mlくらいで十分だと思います。濃度で、1から3マイクログラム/マイクロリットルになると思います。

その半透明なペレットにTEをかけて、すこしたってから、TEをかけながらチップで擦れば、溶けると思いますよ。完全に溶けたかどうかは、わかりませんが、目で見て変なものが見えなければ、現実的には問題にならないと思います。

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