大腸菌を用いて15k程度のタンパク質を発現させてるんですが、ほとんど不溶画分にいってしまい、現在は変性剤等を用いて可溶化を試みています(低温培養、アルギニンの導入はダメでした)
そこで初歩的な質問なんですが、
1、変性剤を用いるとタグまで変性してしまうのでしょうか?また、タグが変性してしまった場合、樹脂には吸着しないものなんでしょうか?(使っているタグはGSTです)
2、変性剤でタンパク質をグチャグチャにし、その後変性剤を取り除き、タンパク質を巻き戻すことで可溶化させるという手法において、どの段階で可溶化が起きているのかがわかりません
「タンパク質が正しい構造をとった状態(refolding)=可溶化した状態」ということなのでしょうか?それとも変性した段階で可溶化が起っているのでしょうか?
よろしくお願いします。
No.2ベストアンサー
- 回答日時:
GSTは変性させるとだめですね。
一度変性させて、refolding後に精製するという方法もやられているようですが、GSTでうまくいくプロトコールがあるか分かりません。http://www.cosmobio.co.jp/technical/tech_NVG_200 …
http://www.emdbiosciences.com/docs/docs/PROT/tb2 …
タンパク質の可溶化というのはタンパクの変性と直接関係ありません。たんぱく質が水溶液に溶けたかかどうかです。変性はたんぱく質が従来の構造を失い、失活した状態です。
たんぱく質が水溶液に溶けない理由はいろいろありますが、表面に露出している疎水せいの部分がくっつきアグリゲーションが起こるなどの理由が考えられます。したがって可溶化するために疎水結合を切る試薬をよく使います。このような試薬はたんぱく質の構造を支えているタンパク質分子内の疎水結合も切ってしまうことがあります。そうするとたんぱく質は変性した状態にならざるおえません。可溶化にともない変性することがあるということです。
refoldingはこのような壊れた構造を本に戻す作業です。このこと自体も可溶化に直接関係ないということが分かってもらえたと思います。
わかりやすい説明ありがとうございます。
変性剤の目的はタンパク質の変性を起こすことでなく、凝集の原因である疎水性結合を切ることで可溶化させているんですね。
どうもありがとうございました!
No.3
- 回答日時:
1. ファルマシアの説明書には一応、2-3 M のグアニジン塩酸や尿素、2%のTx-100、1%のCTAB、10 mM DTT、0.03%SDSの存在下の変性条件でも、GST融合タンパク質をグルタチオン-S-Sephroseゲルでアフィニティー精製しうる(成功例がある)とあります。
そういう条件下でも吸着するかどうかはケースバイケースでしょうけれど。私は、GSTとMBPの融合タンパク質で不溶化したものを、メーカーが許容範囲といっている変性条件でアフィニティー精製したことがありましたが、うまくいった試しがないです。
2. 大腸菌で発現したタンパク質が不溶化するのはinclusion body、封入体を形成するからです。これは、大量発現した外因性のタンパク質が、めちゃくちゃに折り畳まれて不溶性のかたまりにまとめられたものです。そうやって、タンパク質を不溶性、不活性の状態にすることで細胞を保護する一種の防御反応とも言えるでしょう。
封入体を変性剤で処理すると、折り畳みや凝集が解除されて可溶化します。しかし、変性状態なので正常な折り畳み構造はできず、多くの場合活性もありません。
これから、適当な条件で変性剤を除くとか、シャペロニンを加えるとかすると、正常な折り畳み構造が出来る場合があるのです。天然状態のタンパク質は、ふつう細胞内で可溶性ですから、正常な折り畳み構造を持ったタンパク質は可溶性である可能性が高いのです。
あまり高い濃度の変性剤ではアフィニティー精製できなのですね。
>天然状態のタンパク質は、ふつう細胞内で可溶性ですから、正常な折り畳み構造を持ったタンパク質は可溶性である可能性が高いのです
つまり、変性剤を取り除き、かつ可溶化していれば正常な構造をとっている可能性が高いというこですね。
勉強になりました。ありがとうございました!
お探しのQ&Aが見つからない時は、教えて!gooで質問しましょう!
似たような質問が見つかりました
- 化学 エライザ法についての質問です。 抗体がマイクロプレートに吸着する原理について少しわからないところがあ 1 2023/07/14 17:40
- 火災 【危険物取扱者の取得者に質問です】 水溶性の水に溶ける危険物には水消化をしてはいけないのでしょうか? 1 2022/05/22 19:29
- 糖尿病・高血圧・成人病 肝臓が悪い場合の食事療法 昔は低タンパク低脂質高炭水化物だったのが、近年は高タンパク質低脂質低炭水化 1 2022/04/17 13:21
- 化学 化学です!教えてください! 問題は写真です問2の問題なんですけれどbが分かんないです 答えは「NaO 1 2022/11/15 16:44
- 食べ物・食材 無洗米と通常の精米で栄養価的にいうと、米の主成分である炭水化物やタンパク質には大差は無いようですが、 4 2022/05/16 15:21
- 化学 引火性物質の蒸気圧について 0 2023/02/16 20:19
- 化学 こんにちは、昨日もこのような質問を上げたんですが、 また知りたいことがあるので投稿いたします。 引火 1 2023/02/19 23:11
- 生物学 【生命科学】ヒトが1日に消費するATP量?(精度を変えて再計算) 3 2022/10/07 18:48
- 化学 化学が得意な方に質問です。この問題の正解を教えて欲しいです。 【問題1】Log Kowの記述について 1 2022/09/26 23:44
- 化学 ナトリウムとカリウムの何の違いが石鹸の固形と液体の違いを生むのですか? 20 2023/06/24 16:20
おすすめ情報
デイリーランキングこのカテゴリの人気デイリーQ&Aランキング
-
精液について
-
電気泳動 SDSの熱処理について
-
タンパク質は大きく分けて膜タ...
-
体組成計の項目
-
遺伝子とタンパク質 どっちが先
-
タンパク質の凝固
-
糖分制限すると
-
卵白アルブミン=オボアルブミ...
-
150KDa~200KDaの範囲のたんぱ...
-
遺伝子の分野で「コード」って...
-
組織からのタンパク抽出の際の...
-
吸光度比
-
mRNAレベルとタンパク質レベル...
-
電気泳動前のサンプル処理での...
-
GST融合タンパク質発現ベクター...
-
細胞内における DNA mRNA rRNA ...
-
Mature peptide
-
タンパク質ってボルテックスし...
-
ウィルスDNAのORFとはど...
-
DNAの抽出実験のトリプシンにつ...
マンスリーランキングこのカテゴリの人気マンスリーQ&Aランキング
-
精液について
-
糖分制限すると
-
電子レンジでタンパク質が毒に...
-
1食28gあたり、たんぱく質 21g ...
-
食器のタンパク質汚れは水のほ...
-
「カルノア液」について教えて...
-
タンパク質の凝固
-
電気泳動前のサンプル処理での...
-
タンパク質をボルテックスできるか
-
電気泳動 SDSの熱処理について
-
教科書にDNAからRNAポリメラー...
-
吸光度比
-
卵白アルブミン=オボアルブミ...
-
生物学です。酵素を「タンパク...
-
タンパク質は大きく分けて膜タ...
-
Mature peptide
-
CTAB法におけるクロロホルム/...
-
遺伝子の分野で「コード」って...
-
タンパク質ってボルテックスし...
-
血の付いた
おすすめ情報