ブルー・ホワイトコロニーセレクションについて

lacＺ、X-gal,IPTGを用いたブルー・ホワイトコロニーセレクションにおいてのことなんですが、
白色のコロニ－の菌には、
挿入断片を含むプラスミドベクター（今回使ったのはpMW118というものです）
が入っているんですよね。

でも、白色コロニーから、プラスミドの調製を行なって制限酵素で切断して、
電気泳動を行なっても、ベクターのみの時と変わらないバンドパターンを
示す事があるんですが、これっていったいどういうことなんでしょうか？

No.1 ベストアンサー 回答者： ollin 回答日時： 2001/01/15 16:12

もっと為になる回答があると思うのですが、取り敢えず思ったところを…

ブルーホワイトセレクションというのは、目的の断片じゃなくても、
何かが挟まってしまえばコロニーは白色になってしまうものですよね？
ということは、何かの拍子にできてしまったごく小さな、
それこそ電気泳動では判らないような小さな断片が挟まってしまって
それでコロニーが白くなってしまったのではないでしょうか。
はたまた目的の挿入断片が短すぎてバンドパターンの変化が
観察されなかったとか…それはないですか…

ベクターを作る時に、丁寧にやらないとDNAが混入したりして
思った結果が出ないこともありますので、参考まで。

この回答へのお礼

そうですね。
確かに、コロニーが白色になるという事は、挿入断片があるということですね。

微小な断片の出所がどうなっているのか気にはなりますが、
『何かの拍子にできてしまったごく小さな、
それこそ電気泳動では判らないような小さな断片が挟まってしまって
それでコロニーが白くなってしまった』というのは合理的ですね。


それなら、ベクターのみのものと、区別はつかないですね。

「ＤＮＡの混入」だとするのなら、
なんとかそうならないように気をつけるしかないですよね。

ollinさん、ありがとうございました。

お礼日時：2001/01/16 15:11

No.2 回答者： m_nkgw 回答日時： 2001/01/15 18:27

ollinさんの回答でそのまま正解かと思われますが・・。

制限酵素で切ってもごくまれに切断部位が欠けてしまうこともありますし、さらに希ですがもともと発色しないベクターが混じっていることもありますし、２つのベクターが互い違いにくっついてしまうこともあります。インサート部分がベクターと偶然まったく同じ大きさのこともあります。
また、制限酵素の種類によっては活性が低く、全ての切断部位を正しく切ることができないものもあります。（この辺のことは酵素のカタログに載っています）

全ての実験結果がベクターのみとまったく変わらないバンドパターンだった場合は、実験段階で問題があるかもしれませんが、そうでないときは、それは実験誤差の範疇に入ると思います。そういう誤差を取り除くため、精製したサンプルの全てをチェックするのだと思うのですが、いかがでしょうか？

この回答へのお礼

『インサート部分がベクターと偶然まったく同じ大きさのこともある』
確かにそれなら電気泳動では区別できませんね。

『制限酵素で切ってもごくまれに切断部位が欠けてしまうこともある』
そんな事があるんですか。それは考えた事ありませんでした。

あと、『実験誤差の範疇』といった考え方も
頭の中に留めておく必要があるのでしょうね。

m_nkgwさん、ありがとうございました。

お礼日時：2001/01/16 15:21