HPLCのプレカラム法のやり方

ある物質の検出を頼まれたのですが、UV吸収も蛍光もなく、
（MSは機器がないため検討もできません）
文献上の緒言ではニトロ基のある試薬を反応させ
（nitro～と書かれていた気が・・・）
プレカラム法で蛍光検出ができると書かれていました。
（文献は請求中なので詳しいやり方が今のところわかりません）

今まで１回もプレカラム法でやったことがないため
プレカラム法がどのように行うのか、どの程度器具や手間ひまがかかるのか皆目検討もつきません。
そこで質問なのですが、プレカラム法というのは手間ひまが
どれ程かかるものなのでしょうか？
（種類や方法によってピンキリなのでしょうが、回答者様が行ったことのある方法でよいので参考に教えてください）

サンプルの除タンパク目的で有機溶媒を加えるみたいに、
サンプルに試薬を加えて数分待てばOKなどというような
簡単な方法も中にはありますかね・・・？

No.2 ベストアンサー 回答者： Akikan_sin 回答日時： 2008/09/18 23:13

数分待てばok…という超簡単なものはないかもしれませんが、生物屋さんでもやれる方法ならあります。

プレカラム法とは、検出対象に化学反応を掛け、検出可能な誘導体にしてからカラムにかけ検出する方法です。蛍光検出とありますが、特定の官能基と反応するような蛍光試薬が市販されています。その試薬の取扱説明に従えば、特定の官能基を介した蛍光ラベルが簡単に可能です。私がラベルしていた物質は、試薬を混ぜてインキュベート1時間で反応が終わってました。ラベルした後は普通のカラム（HPLC?GPC?)と同様です。

恐らくその論文にあるのは、「ある物質の特定の官能基」と反応して蛍光を発する試薬なのでしょう。が、蛍光を発する化合物なんてたくさんあるので、これだけでは手間についての詳細は分かりません。

プレカラム未経験者ということで、参考程度に聞いてください。

参考URL：http://probes.invitrogen.com/handbook/

この回答へのお礼

ありがとうございました。
１～５時間、インキュベートをかけるとかかれている試薬がありました。１分待てばOKというのも見かけたので、もう少し詳しく調べてみたいと思います。

お礼日時：2008/09/21 21:57

No.4 回答者： caesart 回答日時： 2008/09/19 13:19

No3補足です。

一番簡単なのは移動相に反応試薬を混ぜて測定する方法です。
オキシテトラサイクリン等の測定に用いるイミダゾール、マグネシウム含有の移動相がこれに当たります。

No.3 回答者： caesart 回答日時： 2008/09/19 12:50

プレカラム法の原理はNo2さんがおっしゃってるとおりです。

私が以前にしたことがあるのは、HPLCカラムの前に反応用のコイルをつけて試料の注入時に（インジェクションの後で）反応試薬を混ぜて流路（反応用コイル）に導き、反応条件の温度に設定した反応槽を通してそこでで反応させ、測定用カラムに導入する・・というものでした。
液クロの一部として反応槽がシステムに組み込まれている（場合によっては反応槽用の別ポンプで反応試薬が流れるようになっている）必要があります。
インジェクション→反応用コイル（及び反応槽）→カラム→検出器
という流れになります。

No.1 回答者： elpkc 回答日時： 2008/09/18 15:13

一般的には、プレカラムというのは、実際のカラムの手前につける

短い同じ充填剤のカラムのこと言いますが。
カラムが高価だった頃にカラムの傷むのは、入り口部分の主なので、
分離が悪くなれば、そのプレカラムだけを交換するということをするためのものです。

この回答へのお礼

すみませんでした。
英語をそのまま書いてしまいました。
正しくは蛍光検出の誘導体化のプレカラム法です。

お礼日時：2008/09/18 18:58