酵素活性とDTT

こんにちは。お世話になります。

ある酵素の活性を評価しているのですが、プロトコールにはDTTを入れることになっています。

1.酵素活性におけるDTTの役割は何なのでしょうか？

2.DTT入りのbufferを２週間ほど冷蔵保存して使用したところ思うような酵素活性が得られませんでした。DTTは一般に用時調製するものなのでしょうか？

3.仮に用時調製するにしても毎回微量を秤量するのは効率的ではありません。DTTの濃いstock溶液をつくり一定期間使用することは可能でしょうか？その場合、溶媒、保存方法はどうすればよいのでしょうか？

よろしくお願いいたします。

No.1 ベストアンサー 回答者： akiyamaharuka 回答日時： 2004/01/20 00:23

1.酸化防止です。

基本的なことですからタンパク精製の本にあると思います。ベータメルカプトエタノールも同様な働きです。

2.用事添加が基本です。察するに酸化に弱い酵素なのでしょうね。

3.1Mのストックで私は使用してます。比較的に安定です。ファイナルで1mMほどで使うことが多いので千分の一加えることになります。この場合は水で溶かせば問題ないです。別にバッファーでも問題はないと思いますけど。
使用期間ですが、実験の精度や酵素の性質によるので何ともいえません。10mlも作って分注して試されたらよろしいかと思います。

この回答への補足

早速の回答ありがとうございました。
水で1Mのストックを使用、とのことですが、ストックの保存温度はどうなさっていますか？
よろしくお願いいたします。

補足日時：2004/01/20 05:49

No.3 回答者： takumicchi 回答日時： 2004/01/21 00:25

1>

タンパク質は立体構造を作る時にシステインのSH基どうしが結合しS-S結合（ジスルフィド結合）を作る場合があります（酸化状態）。酵素によってはこのS-S結合が活性の低下を招くことがあります。生体内では酵素が働く条件が正しくコントロールされていますが、試験管内では完全な再現はできませんよね。そこで、バッファー内をDTTやベータメルカプトエタノール(2-ME)を入れて還元状態にすることで、S-S結合の形成を防ぎます。つまりS-S結合を形成すると良くない酵素を用いている場合は反応系の中にDTTや2-MEを入れます。
濃度はpinokoBBさんの使っている酵素によるので、DTTの濃度を振ってアッセイを行い、もっとも高い活性を示す所を見つけることが重要です。

2>
通常は1Mのストックから使い易い濃度に希釈して使っていました。希釈したものは-20℃保存で数回は凍結融解を繰り返しても大丈夫でした。もし気になるようであれば、自分の使い易い濃度に希釈したものをエッペンに数回で使い切る分だけ分注しておいて、ある回数以上凍結融解を繰り返さないようにすることもできます。実際は100回とか凍結融解を繰り返さない限り大丈夫だと思います。

3>
ストックですが10mM酢酸ナトリウム水溶液に溶かして、0.22umのフィルターで滅菌し、1mlずつ1.5mlエッペンに分注して保存しておくのが普通です。一回に10ml分ぐらい作ればよいと思います。酢酸ナトリウム水溶液はオートクレーブ可能ですがDTTはオートクレーブ厳禁です。フルター滅菌のみですので注意してください。保存温度は-20℃以下ならOKです。

こういう基本的なストック溶液の作り方はバイオ実験イラストレイテッド（１）やモレキュラークローニングに載っていますよ。よく使うものですで、借りてきてコピーするか買うことをお勧めします。

No.2 回答者： akiyamaharuka 回答日時： 2004/01/20 16:35

－２０度で十分です。