プラスミドの電気泳動で、白いもやもやしたもの

プラスミドの電気泳動をしているのですが、うまくいかずに困っています。

プラスミドは3600～5100 bp程度で、バンドは出てきているのですが、
それとは別に数万bpの位置に白くもやもやしたものが出たり、「へ」の字のバンドが出たりします。
（マーカーの範囲外ですし、ゲルの分画範囲外です）

何度も同じサンプルを流しても、出たり出なかったりと不安定です。
きっと私の腕が悪いからなのでしょうが、結果が安定しないだけあって
なかなか原因がわかりません。

実験の条件を書きますので、このような「もやもや」や「へ」の字のバンドが出る
という症状に思い当たる方がいましたら、ご指摘お願いします。

簡単なはずの電気泳動で何度も失敗を繰り返していて、
精神的にも詰まってきています。
思いつきや些細なアドバイスなど何でも構いませんので、ぜひお願いします。


空ベクター：3600 bp
　先輩が別の実験で抽出したもので、品質は良い。

プラスミド：5100 bp程度。空ベクターにゲル切り出しで精製した1500 bpインサートを入れ、
　形質転換後ミニプレップで抽出したもの。
いずれも使用前に解凍してタッピングし、チビタンで落としています。

マーカーと空ベクターを１レーンずつ、残りのレーンに抽出したプラスミドを流しています。
ゲル：アガロース 0.8%
135 V、22 min程度

「もやもや」「へ」が出る際は、流したプラスミド全体で出る事が多いです。
逆に、マーカーや何も入っていないレーンに発生することはありません。


よろしくお願いします。

No.2 ベストアンサー 回答者： yuklamho 回答日時： 2012/07/04 09:54

写真ありがとうございます。

「以前はきちんと電気泳動できていたのだから、きちんと突き詰めていけば原因は必ずわかるはずだ。と指示されています。そして泳動がきちんとできるようになったら再度プラスミド抽出するよう言われています。」
質問者さんは卒論生か修士課程の方で、先輩は修士課程の方ですか？分からないからこう言っているのでしょうが、ちょっと無責任のような気がします。まあ、それは本題ではないからいいや。

「へ」の字自体はきっと泳動の条件とかによるものだと思います。50-100Vくらいにしたら真っ直ぐになるかもしれません。

“数万bpの位置に白くもやもやしたものが出たり、「へ」の字のバンドが出たりします。”
写真からの私の印象ですが、プラスミドの精製度がそれほど良くないのかな（大腸菌由来のものが混在している）のかなと思います。高分子のバンドは、もしかしたらスーパーコイルの類いじゃないかという気もします。切らずにプラスミドそのものを流した経験があまりないので。私はいつもサブクローニングしてミニプレップした後、クローニングサイトの制限酵素で切ってインサートを確認し、ポジティブだったら大量調製して濃度と260/280比を測って実験に使っていました。質問者さんはどうして切らずに流されたのですか？インサートが入っていることは確かめられたのですか？

「空ベクター：3600 bp　先輩が別の実験で抽出したもので、品質は良い」
これは、プラスミドを切って精製したものなので大腸菌由来のDNAやRNA、タンパクの混在はないし、直鎖DNAなのでスーパーコイルとかもありません（インサートDNAもそうでしょ？）。

「何度も同じサンプルを流しても、出たり出なかったりと不安定です。きっと私の腕が悪いからなのでしょうが、結果が安定しないだけあってなかなか原因がわかりません。簡単なはずの電気泳動で何度も失敗を繰り返していて、精神的にも詰まってきています。」
これはルーチンワークだし、質問者さんも前回までは上手くいっていたのですから、こんなところで悩まず、さっさとやり直せばいいことだと思います。グリセロールストックがあればそれから増やしなおせばいいし、なければ（今もっているサンプルがインサートの入った正しいプラスミドなら）大腸菌に形質転換しなおして調整しなおせば、それもないのでしたらサブクローニングから。同じサンプルを何回流しても単に時間の無駄ですよ。３回やっても上手くいかなかったら真剣に原因を考えればいいのに。精神的に行き詰れば行き詰るほど実験は失敗します。落ち着いて試薬も新しくして（泳動バッファーも使いまわさず）やり直してみてください。

ただ、研究室の人間関係上、どうしても今のそのサンプルで何とかしなくてはいけないというのでしたら、DNase freeのRNaseA処理をしなおしてフェノール・クロロホルム抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈殿をして、プラスミドそのままと、クローニングサイトの制限酵素で切ったものとを泳動されたらどうですか？何か原因らしきものが分かるんじゃないですか。

頑張って前に進んでください。また、何かありましたら。ここに補足なりお礼なりしてもらえればチェックして答えられる範囲でお答えします。

「専門的な質問サイトもあるのでしょうか。」
私が知っているのは研究留学ネットのBioTechnicalフォーラムです。http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2012/biotechf …
他の用途にも使えます。
http://www.kenkyuu.net/megalink.html
http://www.kenkyuu.net/javascripts.html

No.1 回答者： yuklamho 回答日時： 2012/07/03 11:49

質問するサイトを間違えているような気がしないでもないですが、それはおいておいて。

「何度も同じサンプルを流しても、出たり出なかったりと不安定です。」
同じサンプルって、ミニプレップは1回でそのサンプルを何回か流されたということですか？それともプラスミドの種類は一緒でミニプレップするたびに流すと出たり出なかったりということですか？

「数万bpの位置に白くもやもやしたものが出たり、「へ」の字のバンドが出たりします。
（マーカーの範囲外ですし、ゲルの分画範囲外です）」
「「もやもや」「へ」が出る際は、流したプラスミド全体で出る事が多いです。」
多分、ミニプレップの際のアルカリ処理が不十分で大腸菌のゲノムDNAが残っているのではないですか？それかRNaseA処理が不十分？

それか、プラスミドはプレップした後切らずにそのまま流されているのですか？それだったら、スーパーコイルとかオープンサーキュラーのバンドじゃないのでしょうか？

先輩とか職員には相談されたのでしょうか？
写真でも付けてくれたらもう少し状況が分かるかもしれないのです。

この回答へのお礼

ご回答ありがとうございます。

件の泳動写真ですが、画像の貼り付けがよくわからないため、
プロフィール画像にしました。
露出が低い上に、小さくて見づらく申し訳ございません。
インサート入りのプラスミド (約5 kbp) を流した写真で、
レーン上方が白くなっている部分がご相談したいもやもやです。
もっと強烈に、cccのバンド並みに発色する場合もあります。

この写真ではわからないかも知れませんが、露出を2～4倍に上げて撮影すると
cccのバンドからウェルまで、均一にスメアが伸びており、
ウェルに若干スタックもしているようです。
もやもやは必ず出るわけではありませんが、このスメアやスタックは必ず観察されます。
先輩の抽出物の空ベクターでは、このように長いスメアやスタックは見られません。


＞質問するサイトを間違えているような気がしないでもないですが、それはおいておいて。
専門的な質問サイトもあるのでしょうか。調べてみたいと思います。


＞同じサンプル
わかりにくくてすみませんでした。
ミニプレップ1回に対して何度か泳動して、結果が変化するという意味です。


＞大腸菌のゲノムDNAかRNaseA処理が不十分？
その可能性も考えていたのですが、何度も流してみて結果が変わります。
また、レーンによってバラバラの高さに出たり、
「へ」の字など、バンド (?) が斜めに出る事があるため、
単にゲノムやRNAではないと考えているのです。


＞スーパーコイル、オープンサーキュラー
プラスミドは消化せずに泳動していますが、
cccやOCではなさそうです。


＞先輩とか職員には相談されたのでしょうか
先輩に相談はしております。
しかし、この結果からは何ともわからないと言われました。
恐らく初歩的な間違い、勘違いでもしているのだと思うが、
付きっきりで見ている時間もないので、自力で解決してみなさい。
以前はきちんと電気泳動できていたのだから、きちんと突き詰めていけば
原因は必ずわかるはずだ。と指示されています。
そして泳動がきちんとできるようになったら再度プラスミド抽出するよう言われています。


もっともな話ではあるのですが、現状自力では行き詰ってしまい、
この場で質問させて頂きました。

長くなりましたが、改めてご回答ありがとうございます。

お礼日時：2012/07/03 22:13