プラスミドについて ご存知の方お願いします！

プラスミドマップについて質問させてください。今後プラスミドを扱う大学院生です。
初歩的なことですみません。

マップ内にcodingされている遺伝子のうち、転写の向きが異なるものが含まれていることがあるかと思うのですが、これはまず総論的な話として

１、意図的にあえてそうしたものを作っているのか、そうだとすればそれはなぜなのか
２、たまたま以前の過程でその遺伝子をプラスミドに導入したときに、向きが反対に入ったが関係ない部分なのでそのままにしているのか、

どちらでしょうか。

また上記１に関して各論になりますが F1oriの向きで+/-の表記をわざわざ付け加えているプラスミドがありますが、F1oriの向きを変えることで何か利点があるのでしょうか。

お忙しいとは思いますがサイトや本を見てもしっくりくるものがなくて非常に困っています、よろしくお願いします！

No.2 ベストアンサー 回答者： w6o6n 回答日時： 2012/11/23 06:06

次にいつ書き込めるか分からないので答えておきますね。

実験用途と照らし合わせて考えると良いと思います。

・動物細胞などに使う発現ベクターやT3/T7/SP6 promoterのベクターでインサートの向きが反対
＝アンチセンスRNAを発現、またはin vitroで合成させるために作った可能性があります。
線虫などを研究対象にしている場合、その可能性は高いと思います。
Mammalianを対象にした時期もありましたが、RNAiの仕組みが分かった今とあっては…使えませんね^-^;
(ESでは有効という話も聞きますが、詳しくは知りません）

几帳面な人がハズレクローンを保存してただけかも知れません。。


・クローニングベクターのLacZとインサートの向きが反対
＝たまたまだと思います（向きが問題にならない）。


クローニングベクターにもT3/T7/SP6 promoterがあったりするので
こうなってくると単純にクローニングしただけなのか、意図的にそうしたのか、見分けはつかないと思います。

またベクター構築の際、MCSを拝借したりするために、機能上全く意味のない中間体ベクターを作ることがありますので、
使途不明のベクターは詮索してもあまりメリットはないと思います^-^;

この回答への補足

w6o6n様、お忙しいところご丁寧な回答どうもありがとうございました！
インサートの向き、F1oriについてかなり理解が深まりました。

ひとつだけ、、、

＞動物細胞などに使う発現ベクターやT3/T7/SP6 promoterのベクターでインサートの向きが反対
＝アンチセンスRNAを発現．．．

のところがよくわかりません、、
逆向きに入れるとアンチセンスDNAが転写されてアンチセンスmRNAができるということでしょうか。
逆向きに入れてセンスDNAが転写されることは起こらないのでしょうか？

初歩的な質問にお付き合いさせて申し訳ないです。。よろしくご教示ください。

補足日時：2012/11/24 11:14

この回答へのお礼

ありがとうございます！回答補足すみませんm(_ _)m

お礼日時：2012/11/24 11:15

No.3 回答者： w6o6n 回答日時： 2012/11/24 15:25

補足拝見しました。

>逆向きに入れてセンスDNAが転写されることは起こらないのでしょうか？

転写の仕組みにおいて、このようなことは起こりません。
転写では「鋳型となる一方の鎖(鋳型鎖)のみが使われ」、鋳型鎖に対して相補的なmRNAが作られますが、
もう一方の鎖を鋳型として使うことはありません。

Promoter cDNA Terminator
5'-Promoter|---CCATGAAA--------|Terminator-3'
3'-Promoter|---GGTACTTT--------|Terminator-5'

上記のような２本鎖のDNAがあった場合を想定します。(CCATGAAAとかは配列の１例で特に意味はありません)

Promoterから下流のcDNA配列が転写されますが、この時鋳型として使われるのは「下の鎖と決まっています」。
このため、得られるmRNAは

5'---CCAUGAAA--------3'

になります。

なので、
3'---GGUACUUU--------5' (= 5'-------UUUCAUGG---3')
というアンチセンスRNAは勝手に作られません。

＊＊＊

上記のようなアンチセンスRNAを作りたければ

Promoter cDNA Terminator
5'-Promoter|--------TTTCATGG---|Terminator-3'
3'-Promoter|--------AAAGTACC---|Terminator-5'

という逆向きのプラスミドを作る必要があります。

この回答へのお礼

ありがとうございます！
めちゃくちゃスッキリしました。
言われてみると当たり前のことが一人でいろいろ紙に書いて訳がわからなくなってました。
ここ2，3週間モヤモヤしていたものが晴れました。
本当に本当にありがとうございました！

お礼日時：2012/11/24 16:13

No.1 回答者： w6o6n 回答日時： 2012/11/23 01:22

質問なさっているベクターについてですが、

pBlueScriptなどのクローニングベクターですか（LacZの転写の向きと逆だったりする）？
それとも動物細胞などに使う発現ベクターですか？

F1oriは、昔f1ファージを使って１本鎖DNAを作らせ、シークエンス等に用いていました。
+/-とでは作られる１本鎖が異なる（+で作られる１本鎖は、-で作られる１本鎖の相補鎖）ので、用途に応じて使い分けていました。
近年代替技術が進歩したため、すっかり使われなくなりました。そのため今では特に利点は無いです^-^;

この回答へのお礼

ありがとうございます！！

お礼日時：2012/11/24 11:15