細胞培養のトリプシンEDTAの毒性

細胞を剥がすときトリプシンEDTAを使っています。
細胞を剥がしてから細胞数をカウントする工程が多々あるのですが、細胞数を計測している時間(10～多い時で30分)は細胞はトリプシンEDTAに浸かった状態のままになります。

トリプシンEDTAは細胞にとって毒性があると思いますが、何分ぐらいなら細胞をトリプシンEDTAにつけていても大丈夫なのでしょうか。

また細胞を剥がして、少しの間放置しなければならない場合、細胞に負担がかからない何か良い方法はあるのでしょうか。

ご教授お願い致します。

No.1 ベストアンサー 回答者： w6o6n 回答日時： 2013/02/22 21:10

「トリプシン→カウント→反応停止」ではなく、

「トリプシン→反応停止→カウント」が正しい手順です。

細胞毒性の観点から、トリプシン処理は通常数分で終えるべきです。
十分解離したら、直ちに培地を加えるなどして反応を止めましょう。

>また細胞を剥がして、少しの間放置しなければならない場合、細胞に負担がかからない何か良い方法はあるのでしょうか。

インキュベーションを37Cから室温にすれば負担は減るかと思います。
どちらにしても、最低限の反応に留めることを最優先すべきではないかと思います。

この回答へのお礼

ありがとうございました。
トリプシンの反応を停止させてからカウントをする事が正しいのですね！
今後の参考にさせて頂きます。
お礼が遅くなり申し訳ありませんでした。

お礼日時：2013/03/25 19:18

No.4 回答者： otx 回答日時： 2013/02/24 21:48

あまりこういう書き込みは好ましくないのですが、しょうがないです・・・

細胞を剥がすときに室温であるとかは、まぁ当然でしょうし、
それよりも、質問者さんの質問は、

＞細胞数を計測している時間(10～多い時で30分)は細胞はトリプシンEDTAに浸かった状態のままになります。

が、どうなのか？ということであるので、

通常は、剥がすときだけトリプシン溶液で、
はがれたら、即、培地などタンパク質溶液で洗って（懸濁する遠心する液をのぞく）
細胞を培地に懸濁した状態でカウント、カウントの間おいておく

ということを行うというアドバイスでした。

No.3 回答者： w6o6n 回答日時： 2013/02/24 14:27

補足です。

トリプシンに弱い細胞に対し、室温で反応させるのは常套手段です。
最近は細胞にやさしいトリプシン代用品が出てきていますが、以前はなかったので適宜工夫したものです。

No.2 回答者： otx 回答日時： 2013/02/24 11:58

まず、確認ですが、トリプシンとは「タンパク分解酵素」です。

(EDTAはトリプシンの働きを抑えてしまうイオンを除くために加えてある)

細胞がシャーレに張り付いてるのを、タンパク質を壊すことで
剥がしているのです。

想像してください。そんな溶液にずっと細胞が浸かっているのですよ？
何分大丈夫とかではなく、出来るだけ短時間にするべきです。

これは細胞培養の基本中の基本ですが、
細胞をトリプシン溶液で剥がしたら直ぐ、その細胞を含む溶液を
培地にいれて遠心して細胞を沈殿させ、
培地を取り除いて新しい培地を加えて細胞を懸濁して
それの細胞数をカウントする。

これが普通の方法です。

室温以下にしても、トリプシン溶液で細胞をおいて置くというのは
聞いたことがありません。