乳酸菌から抽出した5KbのプラスミドとpUC19ベクターをXba1で消化後、ライゲーションしてE.coli5αにエレクトロポレーションしてIPTG,X-Gal含有LBプレート上で白色のコロニーが出現しました。そのコロニーを培養してプラスミドの抽出を行い、Xba1で消化すると2本のバンドが確認されたのですが、再び培養後に抽出を行い、電気泳動を行うとpUC19のバンドしか確認されませんでした。これはどういうことなのでしょうか?組み込まれたインサート部分が形質転換後にベクターから脱落することってあるんでしょうか?

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A 回答 (2件)

 昔自分も同じようなことがありました。

コロニーから拾うものはかなりの高さで遺伝子の確認が出来ましたが、培養を重ねていくと脱落するのかは分からないですが、確かにバンドが見えなくなっていました。
 考え方ですが、コロニーから拾ったときに全てが形質転換したものではないはずですから、それを拾っている可能性があります。下記の方が話されているように、
大きな系で行うと、形質転換していないものも増殖している可能性はあると思いますし、脱落も考え難いですが、遺伝子の長さが大きいと、やはり菌には負担が掛かるので、脱落も考えられると思います。(あくまでも持論です) 
 培養に、抗生物質をつかってスクリーニングされているようでしたら、自分の考え難いと思います。

 上手く培養して行く方法としては、大きい系で行ったら、再度スクリーニングを行う為、固形培地に戻し、白色コロニーを拾う様にして、培養を続ける事が出来ると思います。固形培地も冷蔵庫で冷やしていますが、長くは持たないので、定期的に移植して行くと、形質転換体を保持できると思います。
 その前に、-70℃などのフリーザーで凍結保存させた方が良いと思いますが。(多分、分かって見えますよね)
 次の段階に移る場合は、移植を重ねたものでは無くて、凍結していたものからコロニーを作ってその系から行ったほうが、菌も新鮮で、リスクが少なくなりますから、こちらもお勧めします。
 (既に分かっている事でしたら失礼します)
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この回答へのお礼

大変参考になりました。やっぱり、大きいと脱落しやすいんですね。また形質転換は行う予定ですので、アドバイスを参考にさせていただきたいと思います。ありがとうございました。

お礼日時:2001/07/19 18:15

insureさんの増幅されているDNAがどのようなものであるか、培養条件、保存条件はどうであるかによって、脱落であるかどうかは変わってきますが、Small Scaleで培養に成功してもLarge Scaleでは脱落してしまうこともありました。

また、Large Scaleにしたとたん、Insertがどんどん目減りしていって、必要な長さに満たなくなってしまうこともありました。配列によってはベクターを変更したり宿主を変更したりして防ぐことができましたが、それでも脱落してしまう配列もありました。

再実験をしても脱落するのなら。培養条件の見直し、ベクター、宿主の再検討を一度されてはどうですか?
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Q東京でゆっくりエステを楽しめるホテルを探しています

10月の週末にかけて友人2人と東京に行きたいなと思っています。(地方在住者です)
2人とも30代の女性で、今回は仕事の疲れを取る為の「癒しの旅」と決めているので、観光や遊びいうことは全く考えていません。休みもまとまったものは取れず海外旅行は無理なので、その分2泊3日でゆっくりと素敵なホテルライフやエステ、食事を楽しむつもりです。
それで現在宿泊ホテルや利用できるエステ施設を探しています。実際に宿泊されて良かったホテルや旅行プラン、また利用して良かった施設、おすすめのところがありましたら教えていただきたいです。
宿泊ホテルの希望としては
・東京または横浜でお部屋で楽しめる(リラックスできる)
・食事がおいしいまたは近くにおいしいお店がある
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というところです。
エステは絶対にしたいと思っているのですが、別にホテルの中でなくてもかまいません。ホテル近くにエステがあればOKです。(ただし商品を買わされたり勧誘されたりしないところに限りますが・・・)
良いエステの施設も教えていただきたいので、ご存知の方がいらっしゃいましたらよろしくお願いします!

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Aベストアンサー

こんにちは。
私は都内在住なので都内のホテルは利用した事がないのですが、
ホテル内のエステ・スパはよく利用してます。
ホテル内ですから勧誘(化粧品を勧められる)もそれほどしつこくないし、熟練したスタッフが多いですね。
リラクゼーション施設ではほとんど勧誘はありませんよ。
オススメのスパは世界の「マンダラ・スパ」です。
(ロイヤルパーク汐留タワー内)
都内とは思えない空間で、リゾート地に来たような気分に浸れますよ。もちろんスタッフに素人はいません。
友人はフォーシーズンホテル内の「悠 YU,THE SPA」がとても良かったそうです。
参考URLでチェックしてみてくださいね。

参考URL:http://rps-tower.co.jp/mandara/index.html,http://www.fourseasons-tokyo.com/relaxation/index.html

QIPTG、X-galについて

基本的な事なのかもしれないのですが以下のことについて教えてください。よろしくお願いします。
ブルーホワイトセレクションを行う時に、トップアガー液とIPTG、X-galをIWAKIのSterile Tubeを使用して混合させました。
先にアガーをチューブに入れてから2試薬を入れたのですが、このどちらかがチューブの壁に付き、
その部分が白く濁って壁が変性してしまいました。
どっちの試薬の影響なのか解らないのですが、この操作の時にこのチューブは適さないのでしょうか。
ちなみにこのチューブはポリススチレン性です。

Aベストアンサー

X-galのストック溶液は、100%のDMF(dimethylformamide ジメチルフォルムアミド)に溶かして作るのが一般的です。DMFはポリスチレンなどのプラスチックを溶かします(プラスチックシャーレやプラスチックピペットに使われている素材)。エッペンドルフチューブやピペットチップに使われているポリプロピレンは耐性です。

ついでに言うとDMFはニトロセルロースも溶かすので、フィルター滅菌はできません。

考えられる対処法

・ストック溶液を直接チューブにつけないようにする(トップアガーで希釈されれば溶けません)
・ガラスの培養試験管(バクテリアチューブ)を使う。
・バクテリアコロニーを生やすためであれば、トップアガーを使わないで、スプレッダーで塗り広げるだけで十分です。直前にX-gal, IPTGを塗ってから菌を塗り広げればよろしい。

Q東京でエステを探しています

東京で痩身エステサロンを探しています。
前から自分の体型には自信がなかったのですが、
夏になり、肌を見せる機会が増え、
遅いのですがもっと自信を持って肌を見せられる身体になりたいと考えるようになりました。
まずは脚をどうかしたいと考えています。
どこかおススメエステがあれば教えてください。
ちなみに東京住みなので、都内で探しています。

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CMでやっているスリムビューティーハウスはどうですか?
費用面などは気になると思いますが、
やはり本気で細くなりたいのであれば有名なところでお願いした方が良いと思います。

ご参考までに
http://slim.jp/ca/adn/kotsubanbeauty21/?afm=ecmax&vid=b3695&wapr=5770c85a

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お願いします。

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分かりません。

よろしくお願いします。
ちなみに青白判定は行いません。

Aベストアンサー

ANo.1の回答には一部間違いがありますので勝手に補足させてもらいます。
そもそも、pUCタイプベクターは青白選択を行うために開発されたベクターですので、まずはその原理を理解されるのがよろしいかと。

まず、pUCタイプベクターなど、α-complementationによる青白選択を行うためのベクターには、lacプロモーター(lacP)、lacオペレーター(lacO)、そしてlacZ遺伝子のα-flagment部分が乗っています。
http://bio.takara.co.jp/catalog/catalog_d.asp?C_ID=C0329

また、青白判定を行う際にホスト株から野生型lacZが発現しては困るので、このような目的に使うホスト株(DH5α、JM109など)は通常ラクトースオペロンを欠失させています。この遺伝子型は出典によって異なりますがおおよそΔ(lac-proAB)やΔ(lacZYA-argF)U169などと表現されます。
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以上を踏まえ、質問者さんに対する直接の回答としては
「lacO領域を持っているのでIPTGによって発現誘導はかかる。ただし、lacIq遺伝子型が無い場合はIPTG無しでもそれなりに発現する」
となります。

ANo.1の回答には一部間違いがありますので勝手に補足させてもらいます。
そもそも、pUCタイプベクターは青白選択を行うために開発されたベクターですので、まずはその原理を理解されるのがよろしいかと。

まず、pUCタイプベクターなど、α-complementationによる青白選択を行うためのベクターには、lacプロモーター(lacP)、lacオペレーター(lacO)、そしてlacZ遺伝子のα-flagment部分が乗っています。
http://bio.takara.co.jp/catalog/catalog_d.asp?C_ID=C0329

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Q母にエステをさせてあげたい:東京近辺でいいエステ教えてください

田舎から母が遊びに関東に来るのですが、母が「エステをしてみたい」といっています。そこで二人で一緒にいこうということになったのですが、私もエステのお店を知りません。東京近辺(できれば池袋~横浜の間くらい)で、いいエステご存じの方教えてください。よろしくお願いします。

<ポイント>
・母はこの一回しか行けないので、一回ずつの支払いが可能なお店。
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Aベストアンサー

ゲランのエステは、いかがでしょうか?
私は神戸のゲランしか行ったことがないのですが、高級感があってゆったりした気分になれます。
気になるところを言っておけば、それに合わせたコースを選んでもらえます。

ただ、値段は高いです。。。
クラランスやアルビオンも良さそうなので、参考URLで検討してみてくださいね。

http://allabout.co.jp/fashion/skincare/closeup/CU20020709gelan/index4.htm

参考URL:http://allabout.co.jp/fashion/skincare/closeup/CU20020709gelan/index4.htm

Qプラスミドベクターについて

動物細胞へのベクターの導入原理について、悩んでいます。
「プラスミドは自己増殖能を持つ」という記述があるのですが、
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生物の知識はかじった程度で、実験等を進めてきたのですが、
イマイチはっきりとしない箇所が多く、迷っています。
助言を得られたら、非常に幸いです。

Aベストアンサー

こんにちは。
 哺乳類細胞にプラスミドを導入すれば、プラスミドに組み込んだ遺伝子からタンパクを発現させることができます。しかし哺乳類細胞中ではプラスミドは増殖しませんので、一過性の発現しか得られません。
 核内のDNA、つまりゲノムに組み込むためには、レトロウィルスベクターを使う必要があります。この方法ではレトロウィルスに目的の遺伝子を組み込んで哺乳類細胞に感染させ、その遺伝子を宿主細胞のゲノムに組み込んでしまいます。もちろん目的の遺伝子からタンパクの発現が得られます。しかし、現実的にはウィルスの感染効率が悪かったり、しばらくするとタンパクの発現が落ち込んでしまったり、といった問題があります。

Q東京で良心的価格で良いブライダルエステをご存知の方教えてください。

東京で良心的価格で良いブライダルエステをご存知の方教えてください。
痩身も含まれているものがあれば尚うれしいです。

Aベストアンサー

予算が記入されてないので求めているものと違うかもしれませんが…。
私が行ったヴァンベールというエステは、金額がはっきりしていたので安心でした。
コースの値段が選べて、その値段の中で必要なケアを組み合わせれるというものです。
エステによっては「見積もりはご相談をしてから…」なんて書かれているところもあったので、値段が明確なところがいい!と思いそこを選びました。
お店もお店の方もとってもよかったですよ♪

Q形質転換後の大腸菌コロニー

形質転換後の大腸菌コロニーを大量培養したいのですが、振盪培養装置の量的制限もあり、必要なタンパク量まで培養バッチを重ねることにしました。種菌である大腸菌コロニーは培養のたびに形質転換をしなければならないのでしょうか。形質転換してから日数をおいての使用や継代は可能でしょうか。よろしくお願い致します。

Aベストアンサー

最も基本的なプロトコルは、精製した発現ベクターを適切な濃度で-30℃で保存しておき、
必要に応じて、大腸菌(大量に培養されるということなのでたぶんBL21(DE3)株とかかな
と推定します)を形質転換する、と書かれているとは思います。

ただ、実際にやった経験からいうと、
発現ベクターで形質転換した大腸菌BL21(DE3)をLB(amp)液体培地で培養し、OD660nmが
0.5から0.6くらいになったもの3に対して、80%グリセロール溶液1を混ぜたもの
(最終グリセロール濃度が25%程度)を1mLずつエッペンドルフチューブに分注して
-70℃ディープフリーザーで保存しておき、必要時には、それを直接LB培地に
入れて培養する、という方法で基本的には問題なかったです。

プラスミドが抜け落ちると、よく言われますが実際にそういう現象にあたったことは
1回しかありませんでした。

寒天培地で保存は4℃の冷蔵庫で倒置して保存ということになりますが、これは
賞味期限?が短いです。1週間くらいが限度と思ってください。時間がたてばたつぼど
増殖が明らかに悪くなります。継代するなら3日とかくらいの頻度で移し替えて
いかないとだめかな、という印象です。あと、寒天培地をつくったときにまだ温度が
高い状態でシャーレに培地を入れて固めたときには、冷蔵庫で冷やしたときに
水滴がでてびしょびしょになることがあるので、注意してください。

いずれにせよ、

(1)精製したプラスミドは-30℃で保存する
(2)プラスミドを増やす用に形質転換した大腸菌株のストック(たとえばDH5αにプラスミドが
 入っているもの)も上と同じように、グリセロールストックで-70℃保存しておく。
(3)形質転換した発現用大腸菌もグリセロールストックで-70℃保存しておく。

とかしておくと、実験が早く進むと思います。

最も基本的なプロトコルは、精製した発現ベクターを適切な濃度で-30℃で保存しておき、
必要に応じて、大腸菌(大量に培養されるということなのでたぶんBL21(DE3)株とかかな
と推定します)を形質転換する、と書かれているとは思います。

ただ、実際にやった経験からいうと、
発現ベクターで形質転換した大腸菌BL21(DE3)をLB(amp)液体培地で培養し、OD660nmが
0.5から0.6くらいになったもの3に対して、80%グリセロール溶液1を混ぜたもの
(最終グリセロール濃度が25%程度)を1mLずつエッペンドルフチューブに分注して
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Q東京から1泊2日、エステのある温泉ご存知ないでしょうか

友達と二人で温泉に行こうと思っています。
20代後半の女性2名、10月か11月ころを予定しています。
東京から1泊2日で行ける範囲内で、エステのある良い温泉をご存知ないでしょうか??

友達が失恋してしまったのでぱーっとストレス解消できて+エステでリラックスしてもらえればなぁ、と思っています。

宜しくお願いします!

Aベストアンサー

 JTBの楽園というプランがエステのある宿を特集しています。あと、エステではないけれどもJRののんびり小町は、行き帰りがグリーン車で、ホテルの滞在時間も長く設定されていて、喫茶券やお茶菓子のサービスがあるので、女同士で癒しの旅をするにはいいかも(私は、仕事を辞めた時に友人に連れて行ってもらいました。)
 どちらもJTBのパンフレット置き場に置いてあると思います。お友達も早く立ち直れるといいですね。

QpENTRベクター。コロニーPCRができず困っています

こんにちは。インビトロジェンのpENTR/D-TOPOクローニングキットを使って実験しているものです。
Gatewayのエントリーベクターを作成すべく、pENTR/D-TOPOに2kbpのDNA フラグメント(PCR産物)を入れることを試みました。しかし、遺伝子を大腸菌にトランスフォームした後、出てきたコロニー30個を楊枝でつついてコロニーPCRをかけたところ、期待していたインサートのバンドが全く検出されませんでした。
がっかりしましたが、念のために同じ大腸菌を培養してそこからプラスミドを精製し、PCRをかけてみたところ、実はなんと2kbpフラグメントはかなり高い確率でpENTR/Dに入っていたのです。pENTRを使うとこの現象が必ず起き、困っています。
ちなみに、大腸菌DH5α、ベクターpGEM-Teasyの組み合わせで使用したときには、このような現象は起きませんでした。コロニーPCRはKOD',最初に95度5分で処理しています。
精製したプラスミドではPCRはうまくいったのに、なぜコロニーPCRではダメだったのでしょうか?このような事を経験された方はいませんか?それはどのように改善されましたか?コロニーPCRができないと沢山のプラスミドを精製しなくてはいけないので不便しています。

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pick-upはどのようにしてますか?大腸菌Nucreaseの失活は十分でしょうか?
私は面倒ですが大腸菌を別チューブにpickupした後、ボイルしその一部をとってテンプレートにしていました。

プライマーの組み合わせを変えてみては?
両方ともシークエンスプライマーにしてみるとか

KODを使用する意味は?
Taqを使ってみては?

などかと思いますが、どうでしょうか、、、


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