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趣味で生物学を勉強している者です。最近は様々な遺伝子を潰したり入れたりしているマウスがあるようですが、その名称で混乱している部分があるので質問させていただきます。ノックアウトマウスは特定の遺伝子を欠損させているというのは理解できますが、その逆のノックインマウスとトランスジェニックマウスは両者にどのような違いがあるのでしょうか?

よろしくおねがいします。

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A 回答 (3件)

トランスジェニック(遺伝子導入)は、文字通りある生物のゲノムに(染色体に組み込まれたかたちで)、人為的に外来の遺伝子を導入したものです。

ですから、ノックアウトにせよノックインにせよ、トランスジェニックの一種です。組み換えDNA実験の法令のなかでも、すべて遺伝子導入生物として扱われます。

実際の現場では、トランスジェニックは、特に外来の遺伝子を染色体上の不特定の場所に挿入させることをさします。たとえば、ある変異の原因遺伝子がこれであるということを証明するために、正常な遺伝子を導入することで変異体の表現型が回復するかどうかを見るような場合に使います。マウスでは、受精卵にDNAを注射して、妊娠マウスに借り腹させて作成します。

ノックアウトは、ある遺伝子をつぶしたときにどういう異常が起こるかを見るために行われます。これは、狙った遺伝子と相同な配列を持ち、内部に遺伝子の機能を失わせるような欠失や挿入、あるいはストップコドンなどを導入したDNAを入れて、相同組み換えによってゲノム上の遺伝子と入れ替えることによって行います。うまく相同組み換えがおこる頻度は非常に低いので、受精卵に注射するのではなく、細胞培養実験のテクニックを利用して、多数の胚性幹細胞(ES cell)に、どばっとDNAを導入して、そのなかから、うまくいったものをスクリーニングするという方法がとられます。これを、別に採取した胚に移植して作成します。詳しいことは割愛します。

ノックインは、ノックアウトと同様に作成しますが、ゲノム上の遺伝子と入れ替える部分に、何か機能的な遺伝子を入れておくところが違います。たとえば、ある遺伝子の内部にGFP(クラゲ由来の蛍光たんぱく質)遺伝子を導入すると、その遺伝子の発現する場所や時期が、蛍光によってモニターできるようになります。最近では、ノックアウトを目的とする場合でも、発現の指標となるような遺伝子のノックインが同時にできるようにデザインすることが普通になってきました。
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transgenicとknock-inの違いについてですが、transgenicというのは、その名の通り遺伝子改変という比較的広い意味で使用することが多いです。

それに対し、knock-in、knock-outという用語はgene targetingの技術を用いて特定のDNA配列を欠損または挿入することを示します。そのため、knock-outの場合は遺伝子の転写そのものを無くすようなDNA配列を削ったり、タンパクになったときに触媒部位となるDNA配列を削ったりして、結果としては、ほとんどが遺伝子機能を無くすために行われます。それに対し、knock-inの場合はDNA配列の挿入ですので、ご指摘の通り新たな遺伝子を挿入することもあります。しかし、DNA配列を挿入する場所を既存の遺伝子のエクソン内などのcoding regionにknock-inした場合では遺伝子の読み枠がずれて、結果的には遺伝子を欠損さる場合もあります(こういうknock-outに対しては特にノックインノックアウトと呼んだりします)。というふうに、knock-in、knock-outもtransgenicの一種ですが、gene targetingに重点を置いた用語と言う感じでしょうか。
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チョット解り難いかもしれませんが,こちらに説明がありました。



 ・http://www.med.osaka-u.ac.jp/pub/iexas/zitugikyo …
  『 遺伝子改変動物の定義について 』

参考URL:http://www.med.osaka-u.ac.jp/pub/iexas/zitugikyo …
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この回答へのお礼

御回答有難うございます。提示していただいたURL,参考になりました。

お礼日時:2005/03/21 00:18

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Q遺伝子ターゲティングとトランスジェニックマウスの違い。

遺伝子ターゲティングとトランスジェニックマウスはそれぞれどんなものか教えて下さい。特に、遺伝子ターゲティングについて詳しくお願いします(作り方など)。そして、あえて違いを言うなら、この二つはどう違うのですか?面倒な内容ですが、宜しくお願いします。

Aベストアンサー

遺伝子ターゲティングは、遺伝子操作の手法の一つです。
ある特定の遺伝子(ターゲット)を操作すること。
配列を少し変えたり、遺伝子自体をそっくり別の遺伝子と取り替えてしまったり、
あるいは取り出したり。

トランスジェニックマウスとは、遺伝子ターゲティングを含めた遺伝子操作を施されたマウスを指します。
大腸菌は、トランスジェニック大腸菌とは呼ばず、変異株とか呼んだりします。

ノックアウトは遺伝子をつぶすこと。
ノックインは機能する遺伝子を導入すること。
下の方が書いてるように、どちらも遺伝子ターゲティングの1つです。

作り方は様々です。
スタンダードなのは、ベクター(運び屋)と言われるDNAに、目的の遺伝子を組み込み、
それをマウスなどの対象(レシピエント)に導入します。
ベクターにあった遺伝子は、レシピエントのDNAに組み込まれます。

このベクターをどう設計するか、目的DNAがきちんと組み込まれたかどうかは
様々であり、詳しく説明と長くなります。

Qpoly-Aとは

poly-Aとはなんでしょうか?
あとpoly-A付加シグナルについても教えてください。

Aベストアンサー

プロセッシングが完了し完成したmRNAの3'末端には、50~200塩基ほどのアデニン(A)ヌクレオチドが付加されています。これがpoly-A tailです。poly-A tailはmRNAに安定性をあたえ、翻訳を促進する働きがあると考えられています。

mRNAは、まず遺伝子のプロモーターからエクソン、イントロンを含め連続的に転写され、転写の終結部は最後のエクソンよりかなり下流に及びます(真核生物では転写終了位置を示すシグナル配列のようなものは見つかっていません)。
この一時転写産物はイントロンを削除しエクソンを連結するスプライシング、5'末端に一個の7-メチルグアノシン(7-m G)を付加(cap構造といいます)するcapping、3'末端にpoly-A tailを付加するpolyadenylationを経て成熟mRNAになります。

poly adenylationは、最終エクソン内のAAUAAAという配列(polyadenylation signal ポリアデニル化シグナル, poly-A additional signal ポリA付加シグナル)を認識するpoly-A polymerase ポリAポリメラーゼによって行われます。この酵素はポリアデニル化シグナルの10~30塩基下流で一時転写産物を切断するとともに、鋳型に依存せずにアデニンを付加します。なお、ポリアデニル化シグナルには例外も知られています。

参考URL:http://opbs.okstate.edu/~melcher/MG/MGW2/MG234.html

プロセッシングが完了し完成したmRNAの3'末端には、50~200塩基ほどのアデニン(A)ヌクレオチドが付加されています。これがpoly-A tailです。poly-A tailはmRNAに安定性をあたえ、翻訳を促進する働きがあると考えられています。

mRNAは、まず遺伝子のプロモーターからエクソン、イントロンを含め連続的に転写され、転写の終結部は最後のエクソンよりかなり下流に及びます(真核生物では転写終了位置を示すシグナル配列のようなものは見つかっていません)。
この一時転写産物はイントロンを削除しエクソンを連...続きを読む

Q脱イオン水、MilliQ、蒸留水 の違いを教えて下さい

こんにちは。お世話になります。

バイオ、生化学系の実験に従事しているものですが「水」について教えて下さい。

水道水、脱イオン水、MilliQ、蒸留水(二段蒸留水)、超純水の違いを教えて下さい。
お互いの関係などありましたら(○○を~すると△△になる等)教えていただけると
わかりやすいかもしれません。

また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?

よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は除けません。

蒸留法は水を蒸留することで不純物を除く方法です。イオン交換法と組み合わせて2回蒸留することが一般的です。一般的な2次蒸留水の比抵抗は数MΩ・cmでバイオ・生化学関係には十分な純度です。動物培養細胞にも使用可能です。エンドトキシンも完全にフリーとまではいかないけれどもある程度の除去はできています。蒸留法は多くの不純物を除去可能ですが100度付近の沸点を持つ物質は除けません。

逆浸透法は半透膜に圧力をかけて精製する方法です。

限外濾過法は限外濾過膜を通す方法です。孔径は半透膜が数十nmに対し、限外濾過膜は数nmです。それゆえ、数kDa以上の分子であれば、限外濾過法で除けますので、エンドトキシンやRNaseなども除去できます。本当にエンドトキシンフリーな水が必要でしたら限外濾過法を行った水が必須です。ただ、普通のCOSとかHEKとかの動物細胞培養でしたら2次蒸留水でも十分です。蛍光検出用のマイクロアレイなんかは限外濾過水が必須なようです。

超純水は十数MΩ・cmの水のことです。MilliQはミリポア社の超純水装置を用いて作った水で比抵抗は15MΩ・cm以上と高純度の水です。MilliQに関してはイオン交換樹脂を通し、逆浸透法、限外濾過法を用いて精製しているようです。

>また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
これに関しては上で書いたように限外濾過膜で精製した水です。MilliQが当てはまるでしょう。(超純水も一般的には限外濾過をしているのでこれも当てはまりますかね。)

>動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?
これは、2次蒸留水以上の純度があれば十分です。2次蒸留水、MilliQ水、超純水が使用できます。

ただ、水関係の装置は日頃のメンテナンスが重要でイオン交換樹脂とか水を貯めるタンク、蛇口に汚染がないかは確認する必要があります。

実験書には必ずはじめのほうに書いてあることですので、pinokoBBさん自身でなにか実験書をご参照ください。

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は...続きを読む

Qノックアウトマウスとキメラマウス

ノックアウトマウスを作るためにキメラマウスとES細胞が必要である、ということはわかるのですが、なぜこの2つが必要なのかがわかりません。。。

Aベストアンサー

ノックアウトは、狙った遺伝子と相同なDNAの内部を、その遺伝子の機能を失わせるような配列と入れ替えたものを導入して、ゲノム上の遺伝子と相同組換えさせて作ります。

ゲノムのどこに挿入されてもかまわない遺伝子導入なら受精卵に注射しても出来ます(というかそうします)。しかし、相同組換えでうまいこと導入したDNAがゲノム上の標的遺伝子と入れ替わったものが出てくる確率は低いので、受精卵に注射してノックアウトをとるのは困難です。

そこでES細胞が必要になってきます。培養細胞ですのでトランスフェクションの技術でいっぺんに多数の細胞に遺伝子導入できます。薬剤耐性マーカなどを利用して遺伝子導入が成功した細胞を単離培養し、さらに標的遺伝子がデザイン通りにノックアウトされている細胞をサザン解析やPCRで選び出します。だいたい100クローン以上調べるとそういうのが取れてきます。

細胞をノックアウトしただけではマウスにはなりませんから、当たりのES細胞をほかの系統のマウス(ES細胞の由来が黒毛なら白毛のマウスなど)の胚に導入します。

これがうまくいくと、キメラ(毛の色がぶちになっていることで判断できる)ができます。

ES細胞は全能性を持っているので、キメラマウスの体内で、うまいことES 細胞が生殖細胞に分化していれば、生まれてくるマウスの中にノックアウトされたゲノムをもつものが出てきます(全身がES細胞由来なので宿主系統とは毛の色が違う、この状態ではノックアウト遺伝子はヘテロ接合)。

キメラがとれたとしても、生殖細胞にES細胞が行ってくれるかどうかは、これも確率の問題で、ノックアウトマウスが生まれてこないこともあります。

ノックアウトは、狙った遺伝子と相同なDNAの内部を、その遺伝子の機能を失わせるような配列と入れ替えたものを導入して、ゲノム上の遺伝子と相同組換えさせて作ります。

ゲノムのどこに挿入されてもかまわない遺伝子導入なら受精卵に注射しても出来ます(というかそうします)。しかし、相同組換えでうまいこと導入したDNAがゲノム上の標的遺伝子と入れ替わったものが出てくる確率は低いので、受精卵に注射してノックアウトをとるのは困難です。

そこでES細胞が必要になってきます。培養細胞ですのでトラン...続きを読む

QプラスミドDNAの抽出法

実験でプラスミドDNAの抽出をアルカリ法によって行いましたが、アルカリ法の原理がわかりません。
自分でも調べてみましたが、原理はわかりませんでした。
原理をココで教えてくれる方、良いHPを知っている方、何か教えていただけると幸いです。

Aベストアンサー

菌を適当なバッファーに再懸濁します(グルコースが入っているのが一般的ですが、浸透圧をあわせるだけで、あまり重要ではありません)。

アルカリとSDSでタンパク質や膜成分を可溶化し溶菌します。同時に大腸菌のゲノムDNAはアルカリ変性して一本鎖状態になります。スーパーコイル状のプラスミドは変性しにくいのでそのまま残ります(プラスミドまで変性しないように冷やしたり、短時間にします)。

そこに酢酸カリウムなどの塩を加えると急激に中和されるのと同時に塩析作用で、タンパク質-SDS複合体と変性DNAを不溶化します(冷やすこと、時間を置くことで沈殿の形成を促します)。これを遠心分離すると上澄みにプラスミドが残ります。

塩を含んだ上澄みにアルコールを加えると溶けていたプラスミドがアルコール沈殿を起こすので、これを遠心分離して沈殿として回収します。70%程度のエタノールで沈殿から塩を洗い流します。

Qエクセル STDEVとSTDEVPの違い

エクセルの統計関数で標準偏差を求める時、STDEVとSTDEVPがあります。両者の違いが良くわかりません。
宜しかったら、恐縮ですが、以下の具体例で、『噛み砕いて』教えて下さい。
(例)
セルA1~A13に1~13の数字を入力、平均値=7、STDEVでは3.89444、STDEVPでは3.741657となります。
また、平均値7と各数字の差を取り、それを2乗し、総和を取る(182)、これをデータの個数13で割る(14)、この平方根を取ると3.741657となります。
では、STDEVとSTDEVPの違いは何なのでしょうか?統計のことは疎く、お手数ですが、サルにもわかるようご教授頂きたく、お願い致します。

Aベストアンサー

データが母集団そのものからとったか、標本データかで違います。また母集団そのものだったとしても(例えばクラス全員というような)、その背景にさらならる母集団(例えば学年全体)を想定して比較するような時もありますので、その場合は標本となります。
で標本データの時はSTDEVを使って、母集団の時はSTDEVPをつかうことになります。
公式の違いは分母がn-1(STDEV)かn(STDEVP)かの違いしかありません。まぁ感覚的に理解するなら、分母がn-1になるということはそれだけ結果が大きくなるわけで、つまりそれだけのりしろを多くもって推測に当たるというようなことになります。
AとBの違いがあるかないかという推測をする時、通常は標本同士の検証になるわけですので、偏差を余裕をもってわざとちょっと大きめに見るということで、それだけ確証の度合いを上げるというわけです。

QゲノムDNAライブラリーとcDNAライブラリーの違い

ゲノムDNAライブラリーとcDNAライブラリーの違いって何でしょうか?

また、これらのライブラリー中にクローン化されている遺伝子の構造の大きな違いって?

よろしくお願いします

Aベストアンサー

まず、DNA=遺伝子ではないということと、「遺伝子<ゲノム」なのを考えればわかると思いますが、ゲノムライブラリーは、ゲノムを制限酵素で切断したもの全てをライブラリー化したものです。つまり、遺伝子だけでなく、遺伝子ではない部分も取り込みます。
それに対してcDNAライブラリーは、mRNAからcDNAを合成し、ライブラリー化するので、そこには、遺伝子のみが含まれます。
つまり、遺伝子のタンパク発現・機能解析を行いたい時に、cDNAライブラリーを用いる場合が多いです。
クローン化されているものに、違いはありませんよ。ミューテーションを除いて、全く同じものが複製されます。

Qウェスタンブロットのサンプルのinputの意味

今呼んでいる分子生物学系の論文なのですが、ウェスタンブロットの結果のFig中に
C:control、IP:immunoprecipitationの他にもう一つ、inputと書いてあるサンプルがあります。これは一体どのような意味を持つサンプルなのでしょうか。
微妙に専門外なのでホントに基礎的なことだったらすみません。
詳しい方解答よろしくお願いします。

Aベストアンサー

正確な表現ではないですが数式で書くと
Input = IP+ flow through となります。
入れた物 = 抗体についた物+つかなかった物
ただ全量泳動することはできませんので、一般にNo.1のかたが書かれたように1% Inputとか10% inputとして泳動します。
抗体反応中の分解や容器等への付着、洗浄中の脱落および吸着の定量性を示したい場合にはflow throughを示しますが、一般にIPのデーターでは、どのようなサンプルを使用し、抗体でどの程度濃縮されたかを示すにとどめますので、ご質問の3つのレーンとなります。inputには、使用したサンプルにどのくらいの量の目的の因子が入っていたかを示す意義が主ですが、論文中のどこにも%を書いていないものもあります。そのときには、単にそのバンドの高さを示すのみの意味になってしまいます。
メンブレン全体をfigureにする場合には、inputのレーンが抗体の特異性などを示すために使うこともあります。
ご参考までに。

Qトランスジェニック、KO、クローン、キメラ

トランスジェニック、KO、クローン、キメラの特徴と違いを教えて頂けませんか?

Aベストアンサー

トランスジェニック、KOについてはこちらを、
http://oshiete1.goo.ne.jp/kotaeru.php3?q=1276741

クローンは遺伝的に同一の個体たちということです。
大腸菌の単一コロニーも、接木など無性的に殖えたものも、一卵性双子もクローンです。
クローンマウスなどの場合は、卵から核を抜いてdonorの2倍体核を移植して発生させたものをいいます。donorとdonorの核から発生した子孫たちはクローンです。

キメラは一個体の中に遺伝的に異なる細胞が混在するものです。マウスなどでは胚に別の胚からとった細胞を移植して発生させたものがそれにあたります。
KOマウスを作るのにも関係があって、KOを施したES細胞をrecipientの胚に移植してキメラマウスを作る過程があります。

Qnull mutantって?

null mutantとは、どういう変異体のことですか?
遺伝子自体がない変異体ですか?それとも、あるけれども、挿入など、遺伝子中になにがしかの変異が生じて、機能しなくなった遺伝子を持っている変異体のことですか?
どういう変異体をnull mutantというのかわかりません。
教えてください。

それとも、その遺伝子がふつうは生物中にいくつもあるはずなのに、ひとつもないこと・・・・?

Aベストアンサー

下記URLは参考になりますでしょうか…

遺伝学概論
http://www.fides.dti.ne.jp/~fuyamak/genetics/index.html
第4章  眞核生物の遺伝子とその発現
http://www.fides.dti.ne.jp/~fuyamak/genetics/chap4.html
4-2 対立遺伝子間の相互作用
アモルフ(amorph): 
 突然変異遺伝子が形質発現効果を示さない。機能喪失突然変異(loss-of-function mutationまたはnull mutation) ともいう。酵素タンパクをコードする遺伝子の場合、野生型対立遺伝子に対して劣性であることが多い。しかし、遺伝子産物を大量に必要とする遺伝子の場合は優性になることもある。

(例)ショウジョウバエのMinute突然変異
 ショウジョウバエでは、Minuteと総称される数10種類の優性突然変異が知られている。いずれもヘテロ接合個体の剛毛が短くなり、発育が遅延するといった表現を示す。ホモ接合は生存不能なので、Minute突然変異は同時に劣性致死でもある。Minute突然変異はMinute 遺伝子の欠失が原因であることがわかっている。遺伝子そのものが欠けているので、当然のことながらアモルフである。実は、これらの遺伝子座はいずれもリボソームタンパクをコードしていることがわかっている。リボソームタンパクはどの細胞でも大量に必要とされることから、遺伝子が半量ではタンパク量が不足するため、剛毛の形成や発育速度に影響するのである。

参考URL:http://www.fides.dti.ne.jp/~fuyamak/genetics/chap4.html

下記URLは参考になりますでしょうか…

遺伝学概論
http://www.fides.dti.ne.jp/~fuyamak/genetics/index.html
第4章  眞核生物の遺伝子とその発現
http://www.fides.dti.ne.jp/~fuyamak/genetics/chap4.html
4-2 対立遺伝子間の相互作用
アモルフ(amorph): 
 突然変異遺伝子が形質発現効果を示さない。機能喪失突然変異(loss-of-function mutationまたはnull mutation) ともいう。酵素タンパクをコードする遺伝子の場合、野生型対立遺伝子に対して劣性であることが多い。しかし、遺伝子産物を...続きを読む


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