硫安(80%)沈殿を用いて
微生物由来の加水分解酵素を濃縮しました。
1Lを20mLにしたにも関わらず
活性は2倍、タンパク濃度3倍でした。

硫安が原因で失活した例は聞いたことがありません。

遠心後、沈殿せずに漂っていた析出物がありました。
この沈殿せずに漂っている析出物が酵素なのか、
そもそも硫安で析出しなかったのか・・・。

硫安で沈殿させられない酵素は有得るのでしょうか?

A 回答 (2件)

80%硫安でも沈殿しないタンパク質はあります。


一度、上清に残っていないか確かめてみてはいかがでしょうか。
硫安の濃度をもう少し上げるか、時間をかけて沈殿させるなどの方法で解決するかもしれません。

また、
>硫安が原因で失活した例は聞いたことがありません。
というのは、あなたの扱っている酵素についてでしょうか?
一般的には、硫安で失活することはあります。
塩濃度が高くなるとだめなものや、タンパク質濃度が高くなるとだめなものもかなり多いです。
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はずしているかもしれませんが、培地が糖リッチである条件の時に、硫安塩析が非常にやりづらかったことがあります。


糖の濃度と相関があるかまで調べておりませんが・・・

対象の菌はasp.oryzaeでした。酵素はプロテアーゼだったのでそんな特殊なものではないと思います。
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そういうもの(データ)が載っているサイトもしくは、
本を知っている方がおられましたら、教えていただきたいのですが。
とくに、血漿成分のやつを。
よろしくお願い致します。

Aベストアンサー

比較的手に入りやすい入門書としては,新生化学実験講座1「タンパク質1,分離・精製・性質」(東京化学同人)あたりが適当。英文ものでは,Methods in Enzymologyシリーズの最初の方に総説があったと記憶しています。こちらの方は論文等引用しても十分に通用するもの。
以上,参考にしてください。

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調べること,考えること,それらの方法を経験し習得すること
ですね.がんばってください.

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主にコンピューターばっかり使っているので,
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たぶん,糖・炭水化物・油分なども含まれている.
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しらべてわからなければ,原理から予想しましょう.

どうでしょう.
上記のことから想像すると,たぶん,
「卵黄に含まれている蛋白質」が答えだとは思いますが,
大嘘かもしれません.
色はあまり気にする必要はないと思いますが,気にするべきかもしれません.

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よろしくお願い致します

Aベストアンサー

No.2です。

定量精度低下には繋がらないでしょう。
5%TCAで精度が疑われるのなら、通常の脱色液(エタノール+酢酸)でも然りです。

もちろん、染始めや完全に脱色してしまった後は精度云々の話ではなくなります。

脱色は、タンパク質がない部分のバックを減らすのが目的ですので、バックが無視できる濃さ
(バンドがキレイ確認できる濃さ)になれば、定量することができるでしょう。

CBBのバンドを定量するのは、主に目玉ですが、バンドの濃さと太さを定量してくれるソフトもありますね。
データを客観視するなら、このようなソフトを使うのが良いと思います。
CBBやウェスタンのバンドを定量化してグラフを描いたりしている論文もありますが、バンドを囲う時にバイアスも多少かかるでしょうから、あくまでCBBでの定量は、「バンドの定量値」としてお考えになるのが良いと思います。

バンドが複数で目的のタンパク質にタグが付いているならタグによる精製、分子量が違うならゲル濾過後に定量、トータルタンパク量で良いならUVやBCA基質でのタンパク質定量もできます。

CBBでの定量だけに拘らず、他の方法でも目的のタンパク質を定量できるのであれば、定量することをお勧めします。
その方が人を説得させられるし、先入観のない正しいデータを出すことができます。

ではでは、頑張ってください。

No.2です。

定量精度低下には繋がらないでしょう。
5%TCAで精度が疑われるのなら、通常の脱色液(エタノール+酢酸)でも然りです。

もちろん、染始めや完全に脱色してしまった後は精度云々の話ではなくなります。

脱色は、タンパク質がない部分のバックを減らすのが目的ですので、バックが無視できる濃さ
(バンドがキレイ確認できる濃さ)になれば、定量することができるでしょう。

CBBのバンドを定量するのは、主に目玉ですが、バンドの濃さと太さを定量してくれるソフトもありますね。
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Qキサントプロテイン反応について

キサントプロテイン反応で、黄色になった後にアンモニアを加えたんですが、この後冷やすとなぜ色が橙色に変化するのでしょうか?

Aベストアンサー

こんにちは。
まず、キサントプロテイン反応その物の原理は御存じでしょうか?
↓がよくまとまってると思います。ページの中ほどの「キサントプロテイン反応」の項目をご覧ください。

http://www.water.sannet.ne.jp/masasuma/masa/q98-11.htm

それから、アンモニアを色がオレンジになるというやつですが、何もアンモニアである必要はありません。
アルカリ性なら何でもよく、ベンゼン環にニトロ基が付いた物質(芳香族ニトロ化物)はアルカリ性になると色がオレンジ色になる性質があるからです。
フェノールフタレインなどがアルカリ性で赤くなるのと同じ様な理屈です。

まとめますと、キサントプロテイン反応は、タンパク質の中にあるベンゼン環を持つアミノ酸と濃硝酸が反応して、そのベンゼン環にニトロ基が付く反応です。
このニトロ化したベンゼン環はそれ自体が黄色っぽい色を持ちますが、アルカリ性にするとオレンジ色になるという事です。
これはpHによって色が変わる性質の為で、中和するなどで元のpHに戻すとオレンジはまた黄色になります。

参考URL:http://www.water.sannet.ne.jp/masasuma/masa/q98-11.htm

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まず、キサントプロテイン反応その物の原理は御存じでしょうか?
↓がよくまとまってると思います。ページの中ほどの「キサントプロテイン反応」の項目をご覧ください。

http://www.water.sannet.ne.jp/masasuma/masa/q98-11.htm

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Q吸光度の単位

吸光度の単位は何でしょうか!?
一般的には単位はつけていないように思われるのですが。。
宜しくお願いします。

Aベストアンサー

物理的には、No.1さんも書かれているように吸光度も透過度も基本的に同じ単位系の物理量どうしの「比」なので「無単位」です。しかし、無名数では他の物理量、特に透過度と区別が付かないので、透過度は"透過率"として「%」を付けて表し、"吸光度"は「Abs(アブス)」を付けて呼ぶのが業界(分析機器工業会?)のならわしです。

Qエクセル STDEVとSTDEVPの違い

エクセルの統計関数で標準偏差を求める時、STDEVとSTDEVPがあります。両者の違いが良くわかりません。
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Aベストアンサー

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Q酵素 分子活性Kcatの算出方法

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よろしくお願いします。

Aベストアンサー

私がよく使っている方法です。
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参考 ヴォート 基礎生化学

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それなりの結果がでるので、そこまで困っていないのですが、
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Aベストアンサー

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