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前回お世話になったものですが ROCHEのWST-1プロトコールで 420-480nmで測定して(A)まではいいのですが、600nm以上の波長で測定したReference(B)とControlで測定結果(C)があるのですが最終的な測定結果は
(A)-(B)?
(A)-(B)?
(A)ー(B)-(C)?なのでしょうか?よろしくお願いします

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A 回答 (2件)

コントロールというのが、ブランク(バッファーや水の入ってないもの)、もしくはバッファーだけのいずれを指すのかわからないのですが、まず、ミディウムでバックグラウンドを測定し、それを0にした上で測定します。

(450nm or 600nmは少しずれていてもかまいません)


1.細胞を入れていないミディウムの450nmと600nmを測定→この値を0とする
2.サンプルのWST-1の波長(450nm)- バックグラウンド(600nm)を測定し、[450nm]-[600nm]の値を測定する。

基本的にはミディウムだけで450nmや600nmに吸収はなかった気がします。ミディウムだけのバックグラウンドが高い場合は、その分だけ測定のレンジが狭くなってしまいます。

でよろしいかと思います。また、不明な点がありましたらおたずねください。

この回答への補足

早速のお返事ありがとうございます。ELISA PLATE READERで行う場合 われわれの研究室ではMeasureとReferenceにそれぞれフィルターを入れるタイプの機械なのですが これだと 勝手に引き算してくれているということなのでしょうか? よろしくお願いします

補足日時:2005/04/06 13:23
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機種によって、操作方法が異なるため、一般論しか答えられませんが、ごめんなさい。



パソコンで制御しているそこそこ新しい機種であれば、measureとreferenceの波長(フィルター)を選択すると、勝手に各々の波長を測定して、引き算を行ってくれます。

もし、そうでなく、各々の測定を手動で行うようでしたら自分で計算しないといけないかと思います。

ご質問に答えられましたでしょうか?
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QWST-1について

タカラバイオ社のWST-1キット『Premix WST-1 Cell Proliferation Assay System』
http://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.asp?unitid=U100003397

と同仁化学製品のWST-1
http://dominoweb.dojindo.co.jp/goodsr5.nsf/View_Display/W201?OpenDocument

なのですがタカラバイオの製品にはPremixと書かれていて何か混合されているような気がするのですが物質や測定原理などは同じものなのでしょうか?
測定原理を参考にしたいのですがタカラバイオの方が詳しく書かれてあるので同じならそちらを参考にしたいと考えています。

Aベストアンサー

タカラバイオ社のWST-1キット『Premix WST-1 Cell Proliferation Assay System』の測定原理は下記ページにあります。

 ・http://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.asp?unitid=U100003397

 同仁化学製品のWST-1の測定原理は下記ページの「生細胞数を測りたい(吸光測定) P-11」の中にあります。

 ・http://www.dojindo.co.jp/protocol/index.html

 御覧頂けば解ると思いますが,どちらも同じ物質(WST-1),同じ原理の測定方法です。

 では,何が違うかという事はこちらにあります。

 ・http://catalog.takara-bio.co.jp/product/ref_faq.asp?unitid=U100003397&masterid=M100003355

 同人化学の製品では『使用時にWST-1と電子結合試薬とを混合して用いる』のに対し,タカラバイオの製品は『両者があらかじめ混合されている』点です。

タカラバイオ社のWST-1キット『Premix WST-1 Cell Proliferation Assay System』の測定原理は下記ページにあります。

 ・http://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.asp?unitid=U100003397

 同仁化学製品のWST-1の測定原理は下記ページの「生細胞数を測りたい(吸光測定) P-11」の中にあります。

 ・http://www.dojindo.co.jp/protocol/index.html

 御覧頂けば解ると思いますが,どちらも同じ物質(WST-1),同じ原理の測定方法です。

 では,何が違うかという事はこちらにありま...続きを読む

QDMEM培地について。

DMEM培地に含まれる

・グルコース
・L-グルタミン
・フェノールレッド
・HEPES

それぞれの効果というか意味を教えてください。

よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

L-グルタミンについては、
http://www.summitpharma.co.jp/japanese/service/s_ATCC_faq_cell_biology.html#q8
「培地にL-glutaminの添加は必要ですか?どの程度のL-glutaminを添加したらよいですか?なぜ information sheetにL-glutaminの記載がないのですか?」
を見て頂けると良いと思います。
最終的にはどの培地にも添加されます。

参考URL:http://www.summitpharma.co.jp/japanese/service/s_ATCC_faq_cell_biology.html#q8

Q脱イオン水、MilliQ、蒸留水 の違いを教えて下さい

こんにちは。お世話になります。

バイオ、生化学系の実験に従事しているものですが「水」について教えて下さい。

水道水、脱イオン水、MilliQ、蒸留水(二段蒸留水)、超純水の違いを教えて下さい。
お互いの関係などありましたら(○○を~すると△△になる等)教えていただけると
わかりやすいかもしれません。

また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?

よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は除けません。

蒸留法は水を蒸留することで不純物を除く方法です。イオン交換法と組み合わせて2回蒸留することが一般的です。一般的な2次蒸留水の比抵抗は数MΩ・cmでバイオ・生化学関係には十分な純度です。動物培養細胞にも使用可能です。エンドトキシンも完全にフリーとまではいかないけれどもある程度の除去はできています。蒸留法は多くの不純物を除去可能ですが100度付近の沸点を持つ物質は除けません。

逆浸透法は半透膜に圧力をかけて精製する方法です。

限外濾過法は限外濾過膜を通す方法です。孔径は半透膜が数十nmに対し、限外濾過膜は数nmです。それゆえ、数kDa以上の分子であれば、限外濾過法で除けますので、エンドトキシンやRNaseなども除去できます。本当にエンドトキシンフリーな水が必要でしたら限外濾過法を行った水が必須です。ただ、普通のCOSとかHEKとかの動物細胞培養でしたら2次蒸留水でも十分です。蛍光検出用のマイクロアレイなんかは限外濾過水が必須なようです。

超純水は十数MΩ・cmの水のことです。MilliQはミリポア社の超純水装置を用いて作った水で比抵抗は15MΩ・cm以上と高純度の水です。MilliQに関してはイオン交換樹脂を通し、逆浸透法、限外濾過法を用いて精製しているようです。

>また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
これに関しては上で書いたように限外濾過膜で精製した水です。MilliQが当てはまるでしょう。(超純水も一般的には限外濾過をしているのでこれも当てはまりますかね。)

>動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?
これは、2次蒸留水以上の純度があれば十分です。2次蒸留水、MilliQ水、超純水が使用できます。

ただ、水関係の装置は日頃のメンテナンスが重要でイオン交換樹脂とか水を貯めるタンク、蛇口に汚染がないかは確認する必要があります。

実験書には必ずはじめのほうに書いてあることですので、pinokoBBさん自身でなにか実験書をご参照ください。

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は...続きを読む

Q培地がどんどん赤くなります

学校で癌細胞を扱っており、液体培地RPMI1640を使っております。

液体培地の封を開けて2ヶ月くらい経過すると培地が赤っぽくなっています。
培地にはメチルレッドが入っているのでアルカリ性になって赤くなるということはわかるのですがふたをきちんと閉めた状態で冷蔵保存しているのにpHがあがっていくのはなぜなのでしょうか?
普段培地は10%FBSを添加した状態で冷蔵保存していますのでFBS添加が原因でしょうか?
できれば培地の管理で大事なことなども含めてアドバイスお願いします。

Aベストアンサー

培地が徐々に赤くなるのは、培地からCO2(炭酸ガス)が逃げているためです。血清は関係ありません。

RPMI1640で使われているpH緩衝液には、重炭酸イオンが使われています。重炭酸イオンは、少しづつCO2と水に分解し、生じたCO2は空気中に逃げていきます。

CO2インキュベータの中では、空気中には5%のCO2が含まれていますから、逃げていくCO2と溶け込むCO2が釣り合って、培地のpHは変化しません。しかし、培地ビンのふたを開けたときにビンの中に入り込むクリーンベンチの内部の空気には、CO2はほとんど含まれていません。

したがって、ビンを開け閉めするたびに、ビンの中のCO2を含む空気は失われ、CO2を含まない空気に置換されます。この空気中に、培地からCO2が放出される、ということの繰り返しで、培地はアルカリに傾いていくのです。

ですから培地のpHの上昇を防ぐには、使用したあと培地ビンの中の空気を、5%CO2を含む空気に置換すればよいのです。このためのガスボンベも市販されています。もっとも、そこまでしているラボはあまりありません。

2ヶ月間同じ培地を使用しているとのことですが、これはあまり好ましくありません。培地の成分の中には、グルタミンなど比較的分解しやすい成分も含まれていますし、開け閉めを繰り返すとコンタミの危険性も増えます。pHの問題は抜きにしても、1ヶ月ぐらいで使い切る量に小分けしておいて、開封後はあまり長く使い続けない方が良いと思います。

P.S.培地に使われているpH指示薬は、メチルレッドではなくフェノールレッドです。メチルレッドは酸性側が赤ですね。

培地が徐々に赤くなるのは、培地からCO2(炭酸ガス)が逃げているためです。血清は関係ありません。

RPMI1640で使われているpH緩衝液には、重炭酸イオンが使われています。重炭酸イオンは、少しづつCO2と水に分解し、生じたCO2は空気中に逃げていきます。

CO2インキュベータの中では、空気中には5%のCO2が含まれていますから、逃げていくCO2と溶け込むCO2が釣り合って、培地のpHは変化しません。しかし、培地ビンのふたを開けたときにビンの中に入り込むクリーンベンチ...続きを読む

Qアガロースゲル電気泳動でサンプルがウェルにスタック

PCR産物(2.5kb)の確認のためにアガロースゲル電気泳動を行っています。しかし、サンプルがウェルにスタックしてしまって、うまく流れてきません。マーカーはきれいに流れています。マグネシウム濃度を振ってPCRをしたのですが、マグネシウム濃度が高いサンプルほどウェルの付近ははっきりと光っているので、実はPCRはうまくいっているのではないかと考えています。どうやったらきれいに流すことができるのか教えてください。また、PCR産物をPCR-purification kitなどで精製して流すと改善されたりするのでしょうか?

Aベストアンサー

おそらくPCRのかけすぎ(テンプレート量やサイクル数が過剰)。
PCR産物がある程度増えた状態で、さらにサイクルを続けると、産物同士のミスアニールから伸長してどんどん長い産物ができます。ひどいときはお書きになったようにウェルにスタックするほど巨大化します。
Mgが多い方が増幅しやすい(反面ノンスペもでやすい)ので、Mg濃度の高い方がはっきり見えたんでしょう。

Q非動化の目的を教えて下さい。

非動化の目的を教えて下さい。

あまりしっかり把握できていないので詳しく教えて下さい。
血清などを”非動化する目的”は何でしょうか。

もうひとつ、非動化と言わず”不活化”という場合もありますが
この2つは同じ意味でしょうか。


初歩的な質問ですみません。
宜しくお願いします!

Aベストアンサー

非「働」化ですね。inactivationの訳語ですので、不活化、不活性化でもいいはずですが、なぜか特定の場面に限り不働化という用語があります。

血清に含まれる補体群を、他の成分(成長因子、免疫グロブリンなど)を失活させないように56℃程度の温和な熱処理によって、不活性化することです。補体は細胞障害性などの生理活性があるので、それを排除したいときに行います(たとえば細胞培養に使うときなど。それでも最近は、可能であれば(とくに影響がないかぎり)非働化処理はしないほうがいいという記述も多い)。

QIC50(50%阻害濃度)の出し方についてご教示ください。

IC50(50%阻害濃度)の出し方についてご教示ください。

とある物質の酵素阻害活性を測定しているのですが、
IC50値の出し方がいまいちわかりません。

現在の実験方法はサンプル毎の阻害率を以下のように求めています。
1.酵素、基質、阻害物質を加え反応させて吸光度を測定
 (反応生成物を比色法で測定しています)
2.得られた吸光度から、ブランクを差し引いて阻害率を求める式にあてはめて
 阻害率(%)を出す
 ((対照-サンプル)/対照)×100

という風に行っていました。
なので、阻害物質の濃度をふって(10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01ug/mL)
それぞれの阻害率を求めて、エクセルで検量線を作って
その式に当てはめて50%の値を求めたらよいのかな、と思ったのですが…
普通に散布図にしたら変な形のグラフになってしまいました。
いろいろ調べた結果、IC50を求めるときはx軸が対数のグラフを作るのでしょうか?
そのとき、阻害物質(x軸)の濃度の振り方も異なってくるのでしょうか?
(たとえば10, 5, 2.5, 1.25, 0.625…のほうが良いとか)

正直、数学が苦手でして対数にする意味などはさっぱりです…
どなたか、ご回答よろしくお願いいたします。

IC50(50%阻害濃度)の出し方についてご教示ください。

とある物質の酵素阻害活性を測定しているのですが、
IC50値の出し方がいまいちわかりません。

現在の実験方法はサンプル毎の阻害率を以下のように求めています。
1.酵素、基質、阻害物質を加え反応させて吸光度を測定
 (反応生成物を比色法で測定しています)
2.得られた吸光度から、ブランクを差し引いて阻害率を求める式にあてはめて
 阻害率(%)を出す
 ((対照-サンプル)/対照)×100

という風に行っていました。
なので、阻...続きを読む

Aベストアンサー

どんなグラフなのかわからないのであれですが

とりあえず、貴方の実験も対数でされているので問題無いです(0.01, 0.1, 1, 10, 0.05, 0.5, 5で実験しているので)
今回の実験をリニア(普通の)軸で取ると、一番右端が10になり左端が0.01≒0になります
真ん中が5、左から1/10が1になるので、右半分は殆どデータがなく左側にばかりデータ点が並ぶことになります
しかも、0.01と0.05, 0.1当たりの違いはグラフで書いて理解するのは困難だと思います
ですので、対数軸を使います
対数軸ですと、0.01と0.1が一目盛、0.1と1が一目盛となるのでデータ点が均一に並びます
あとは、10倍では飛びすぎているので、間の点として5を選んだということで、それぞれの間に5x10^nのデータが並びます

データ点はある程度規則的に並んでいた方が良いですが、厳密に取る必要はないです
(リニア軸でいうと1, 1.6, 2, 2.6, 3, 3.6などでも良い)
ですので今回の濃度のままで問題ないと思います


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