PCRの伸長反応は,用いるDNAポリメラーゼによって僅かに異なりますが,大体70度前後だと理解しています.
ところが,sequence reactionのサイクルでは伸長反応は60度と習いました.
これは普通のPCRで用いるポリメラーゼとsequence reactionで用いるポリメラーゼが全然違うものだからなんでしょうか?

このQ&Aに関連する最新のQ&A

至適温度」に関するQ&A: 至適温度を超えると

A 回答 (1件)

アプライドバイオシステムのシークエンス反応のことだと思いますが、酵素はTaqです。


どうして60度で反応させるのか、、、、、
それは、いろいろためして最適化した条件がそうだからです。
PCRは、伸びればいい、増えればいいですから、酵素の至適温度でやるのがいいわけです。
シークエンス反応は、そういうことを目指しているのではなく、たとえば、ラベル化されたヌクレオチドをバランスよく取り込むとか、鎖長がちがうDNA分子が、偏りなく生成されるとかのほうが大事です。当然、至適化のポイントも違う訳で。

ちなみに、耐熱性ポリメラーゼといっても、室温付近からかなりの活性があります。低温条件でおこる非特異的な反応を防ぐために、ホットスタート法などがあるのもそのためです。
    • good
    • 0

お探しのQ&Aが見つからない時は、教えて!gooで質問しましょう!

このQ&Aを見た人が検索しているワード

このQ&Aと関連する良く見られている質問

QDNAポリメラーゼIIについて。

DNAポリメラーゼIや、IIIについての説明はサイトで見かけたりするのですが、IIについての説明が探した限りどこにもありません。いったいDNAポリメラーゼIIはどのような働きをするのでしょうか??
生物の試験がもうすぐあります。どなたか教えてください。

Aベストアンサー

私もDNApoly2については流す程度にしか習わなかったんですけど…。

DNA修復、紫外線誘導性突然変異に関与しているらしいです。
他に参考先URLを見つけました。

参考URL:http://www.nig.ac.jp/museum/genetic/B/fukusei-02.html

QMetに対する翻訳開始反応、伸長反応のコドンAUGはどのようにして区別されるか?

以下のような問題を出されて困っています。

Metのコードンは翻訳開始反応でも、内部での伸長反応でも同じAUGである。Metに対するこれら2つの翻訳はどのようにして区別されるのか?

という問題です。自分でも調べてみたんですが、よくわかりません。
自分なりの回答としては、「翻訳開始時のみに特異的に使われる翻訳開始メチオニンtRNAがあり、伸長反応用のいずれのtRNAとも異なる特異的な塩基配列を持っており、伸長反応に使われることはない。このtRNAは翻訳開始反応に使われ、他のtRNAは慎重反応に使われることにより、2つの翻訳を区別している」という回答です。
しかし正直言ってあまり自信がありません。
この問題を教えていただけませんか?それが無理なら参考になるサイトを教えていただけるだけでもかまいません。
どうかよろしくお願いします。

Aベストアンサー

転写開始のシグナルはAUGだけでなく、その遺伝子の構造部分の上流に位置するリボソーム結合部位(Shine-Dalgarno配列)をリボソーム前駆体が認識し、結合することが必要である。最初のメチオニル-tRNAはこのリボソーム前駆体に結合している。(そのため、AUG以外のスタートコドン(AGG、AUC)であっても合成されるポリペプチドのN末端はメチオニンである。)
一方翻訳が開始されてからのAUGは他のtRNAと同様に、単純にメチオニンをコードするコドンとして使用される。

いま手元に参考書がないのでうろ覚えですが、大腸菌ではこんな感じだったと思います。

QDNAポリメラーゼについて

校正機能を持たないDNAポリメラーゼは存在するのでしょうか?

存在するとしたら、それはどのような役割を果たしているのですか?

Aベストアンサー

 校正機能、すなわちエクソヌクレアーゼ活性を持たないDNAポリメラーゼは存在します。
たとえば、ヒトのDNAポリメラーゼαはエクソヌクレアーゼ活性を欠いています。
このDNAポリメラーゼは、RNAプライマーとその後に続く十数塩基の複製を行っています。
おそらく、極めて短い領域しか関与しないために、校正機能はそこまで重要な問題ではないからだと考えられています。

Q吸光度計を用いたDNAの純度

 吸光度計を用いたDNAの純度は、A260/A280が1.8~2.0で高純度となり、<1.8だとタンパクなどの不純物の存在が考えられると色々な文献で目にします。
 それでは、>2.0の場合はどのように考えればよろしいのでしょうか?

 260nmは核酸の測定波長で、280nmはタンパクの測定波長だということはわかります。>2.0ということは、核酸の値がタンパクの値より高いということになりますが、これは高純度と評価しても良いのでしょうか?1.8~2.0という範囲なので、高すぎても高純度とは言えない理由があるのではないかと思いますがわかりません。

 ちなみに測定値は
・260nm:0.061
・280nm:0.027
でA260/A280は約2.2となりました。

回答よろしくお願いします。

Aベストアンサー

 純粋な物質には、特定の吸収スペクトルがあります。タンパクは280nm、核酸は260nmに極大吸収があり、その波長がよく利用されています。核酸やタンパクに限らず、純粋な物質は、波長の比は一定の値をとります。
 核酸では、260nm/280nmの吸光度の比だけでなく、260/240,260/250,260/270,260/280,・・・・と、純粋であれば、どの波長の吸光度比も一定の値をとります。

 したがって、純粋なDNAの260/280の吸光度比が1.8であれば、「純粋」であることは否定できませんが、保障するものではありません。
 むしろ、1.8であるハズのものが2.0ならば、純粋でない⇒不純物が混在する、と判断できます。

QDNAポリメラーゼの種類について

DNA合成の勉強をしていて混乱しています。
DNAポリメラーゼはI,III と呼ばれているものは大腸菌にあるもので人のような真核生物にはαとかβとかいうものに区別されている、という認識は誤っているのでしょうか?

Aベストアンサー

合ってます。

Iとか(3)は大腸菌(原核生物全般?)のもので、ギリシャ文字で表されるのが真核生物のものです。
リーディング鎖合成が、Pol(3)(の2つのコアサブユニットのひとつ)かPolε。
ラギング鎖合成が、Pol(3)(のもうひとつのコアサブユニット)かPolδ。
岡崎フラグメントをつなぐときにプライマーをはずしつつDNAを合成するのが、Pol(1)かPolδとFEN1の複合体。
真核生物では、そのほかDNAの修復や組み換えなどに専門にはたらくDNAポリメラーゼがいろいろ(10種類以上)ありますが、大腸菌ではPolIがここでもまた活躍しているようです。

ちなみにRNAポリメラーゼは、大腸菌は一種類(RNAP)しかなく、真核生物は(1)、(2)、(3)があります。

さらにちなみに、大腸菌のDNA Pol(3)は複数のギリシャ文字で表される(←ここがややこしい)サブユニットの複合体(Pol(3)ホロ酵素)で、Pol(3)という単体のたんぱく質や遺伝子があるわけではないです。RNAPも同様。
反対に、真核生物のポリメラーゼ(DNAもRNAも)は、そういう単体の遺伝子やたんぱく質があり、その上で他の複数の関連たんぱく質と複合体(ホロ酵素)を形成してはたらきます。

かなりややこしいですね。
一応調べて書きました。
多分間違いないと思いますが、もし間違いがあれば誰か訂正お願いします。

合ってます。

Iとか(3)は大腸菌(原核生物全般?)のもので、ギリシャ文字で表されるのが真核生物のものです。
リーディング鎖合成が、Pol(3)(の2つのコアサブユニットのひとつ)かPolε。
ラギング鎖合成が、Pol(3)(のもうひとつのコアサブユニット)かPolδ。
岡崎フラグメントをつなぐときにプライマーをはずしつつDNAを合成するのが、Pol(1)かPolδとFEN1の複合体。
真核生物では、そのほかDNAの修復や組み換えなどに専門にはたらくDNAポリメラーゼがいろいろ(10種類以上)ありますが、大腸菌ではPo...続きを読む

QDNAシーケンスでのBigDye で使うポリメラーゼ

実験初心者です。DNAのシーケンシングを行う際に、Big Dye 3.1 というものを入れ、それに目的のDNAとプライマーを入れた溶液を作製し、PCRを行いました。ここで疑問が出てきたのですが、PCRを行う際にはDNAポリメラーゼが必要ですよね? 普通のPCR反応ではポリメラーゼを別に加えるのにここでは加えていません。Big Dye の溶液の中に含まれているのでしょうか? 調べてもBig Dye に含まれる成分が全く出てこなかったので、困っています。もしDNAポリメラーゼが含まれているなら、何の生物由来のものかなども分かると嬉しいです。

Aベストアンサー

BigDyeの詳細な組成は公開されていませんが
ポリメラーゼが含まれているのは
間違いありません。

種類も公開されていませんが
おそらくΔTthか その類だと思います。

QDNAポリメラーゼやプライマーについて

大学生で教科書を読んでいていくつかわからない点があったので教えてもらいたいのですが、

1、DNAポリメラーゼはdATP、dGTP、dCTP、dTTPからDNAを合成するようなのですが、なぜ一リン酸や二リン酸のものから合成することができないのでしょうか?

2、プライマーは、オリゴヌクレオチドですが、教科書を見た限りだと鋳型DNAと同じ構造なのですが、ラギング鎖でニックトランスレーションが必要なことから、鋳型のDNAと構造が異なる点があると思うのですが、どうなんでしょうか?

わかる方回答よろしくお願いします。

Aベストアンサー

誤解を招く書き方をしてしまいましたので、
>つまり、間隔を置いたプライマーから同時多発的に伸長が起こる)。
伸長開始点に関してのことです。一旦開始されると、リーディング鎖はそれ自身がプライマーとなって伸長していくと考えられていますね。

QDNA,RNAの吸光度(濃度)測定について

よく核酸の濃度測定をするのですが,測定の際いつも240nm~320nmの吸光度のグラフを確認しています.

そこでお聞きしたいのですが,
(1)普段は260nmで核酸の吸光度がピークに達し,きれいな山型が描かれますが,時折,240nmの値が高めで右肩下がりのグラフになってしまうことがあります.280nmの吸光度が高いのは蛋白が混入しているものと認識しているのですが,260nm以下の領域が高くなる時はどういったことが考えられるのでしょうか.

(2)それともう一点,吸光度の比『A260/A280値』で,純度が高ければDNAは1.8,RNAは2.0で,当然蛋白が混入すれば比は1.8未満になるのは理解できるのですが,特にRNA濃度の測定の際,比が2.2近くになる事があり,それがどういう意味を持っているのか知りたいと思っています.

どちらか一方でも構いませんので,ご存知の方がおりましたら分かりやすく教えていただきたいと思っています.よろしくお願いいたします.

Aベストアンサー

#2です。参考文献を挙げておきます。

参考URL:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=9067025

Q活性化エネルギーと活性化自由エネルギーの違いは?

活性化エネルギーと活性化自由エネルギーの違いを教えて下さい。

ある一次反応で、アレニウスプロットから活性化エネルギー(Ea)を求めました。
ここからEyring式(プロット?)を用いて活性化エンタルピー(△Hキ)、活性化エントロピー(△Sキ)、活性化自由エネルギー(△Gキ)を求める事が出来るとあったのですが、この場合、反応障壁として「活性化エネルギー=活性化自由エネルギー」ではないのでしょうか?違いがよくわかりません。

よろしくお願いします。

Aベストアンサー

活性化エネルギーはArrheniusの式k=Aexp(-Ea/RT)により求められるものです。
一方衝突説で考えると、Boltzmann分布している分子がEの運動エネルギーをもって衝突すると反応が起こると解釈すれば、速度=Zexp(-E/RT)となります。Zは衝突頻度です。ところでZも温度に依存し、Z∝√Tとなります。Ea=RT^2 (∂lnk/∂T)vと再定義すると、Ea=E+(1/2)RTとなります。しかしその差は小さいです。
活性錯体理論で、活性化ギブス関数は-RTlnK'=ΔG'で定義されます。ここで"'"(prime)は質問者さんがDouble Daggerで書いてあるものです。K'は原系と活性錯体の(仮想的)平衡定数です。
Eyringの理論の帰結をものすごく端折って書くとk∝(T^2)K'の温度依存の式になります。
さて、K'の前の温度依存性T^2をわすれれば、
lnk=Contant+ln K' = Constant+(-ΔG'/RT)となり、
さらにΔG'=ΔH'-TΔS'を知れば
lnk=Constant+ΔS'/R-ΔH'/RTとなります。
すなわち、
k∝exp(-ΔH'/RT)
のようになりますので、ΔH'(活性化エンタルピー)がArrheniusの活性化エネルギーに見えます。しかし微妙に違ってはおりましてk∝T^2 K'ですのでEa=RT^2(∂lnk/∂T)vの定義と対応させると
Ea=2RT+ΔH'
のようになります。(ごたごたした書き方で済みません。)

活性化エネルギーはArrheniusの式k=Aexp(-Ea/RT)により求められるものです。
一方衝突説で考えると、Boltzmann分布している分子がEの運動エネルギーをもって衝突すると反応が起こると解釈すれば、速度=Zexp(-E/RT)となります。Zは衝突頻度です。ところでZも温度に依存し、Z∝√Tとなります。Ea=RT^2 (∂lnk/∂T)vと再定義すると、Ea=E+(1/2)RTとなります。しかしその差は小さいです。
活性錯体理論で、活性化ギブス関数は-RTlnK'=ΔG'で定義されます。ここで"'"(prime)は質問者さんがDouble Daggerで書いてあるもので...続きを読む

QDNAとかのAUG,UAA,UAG,UGAの関係について

本にAUGがDNAのコピーの開始点で、UAA,UAG,UGAは終端記号の意味をしているとありました。でも、実際にDNAを見ていると、AUGがなく、終端ばかりのものや、先端と終端に囲まれていない部分とか、終端記号だけの部分とかあります。どうしてなのでしょう。必ず対になっているのではないのですか?

Aベストアンサー

1.です。

生物の仕組みを、DNA、RNA、蛋白質といった分子的なレベルに
基づいて理解しようと言う学問が「分子生物学」です。
一方、生物(主に分子生物学)にかかわる情報を、コンピューターの
力を利用して解析し、意味を見出す、または、分子生物学の
実験を進めるための助けにしようというのが、
「バイオインフォマティクス」といわれる学問です。

従って、ゲノム配列情報を扱う技術そのものは、
バイオインフォマティクスですが、扱っているものの
意味を理解するためには、分子生物学の素養は必須でしょう。

分子生物学の教科書としては、「細胞の分子生物学」(教育社)
がお勧めです。ただし、非常にボリュームもありますが。
現在、原書(Molecular Biology of the Cell)の4版が
でていますが、日本語版は、ちょうど3版が品切れに
なっているようなので、間もなく4版がでることでしょう。
そのほかには、類書として、「分子細胞生物学」(東京化学同人)
もいいかもしれません。
ちょっととっつきがたい、と言う場合は、細胞の分子生物学の
初心者向けバージョンである、「Essential細胞生物学」(南江堂)
もいいかもしれません。
いずれにせよ、細胞の成りたちと遺伝子発現の仕組みに
ついてきちんと理解しておくことは、一般教養として
以上にこの分野に関わるのであれば必須なことでしょう。

バイオインフォマティクスについては、本当にたくさんの
入門書がでていますので、どれがいいとは一概には言い切れません。
が、とりあえずのとっかかりとしては、
「初心者でも分かる!バイオインフォマティクス」(羊土社)
あたりを読まれてみてもいいのでは無いかと思います。
また、配列解析の仕組みから勉強したいのであれば、
「バイオインフォマティクス ゲノム配列から機能解析へ」
(メディカル・サイエンス・インターナショナル)
が、分厚くて高いですが、お勧めです。

一度、amazon.co.jp辺りで「分子生物学」「バイオインフォマティクス」
で検索してみることもお勧めします。

1.です。

生物の仕組みを、DNA、RNA、蛋白質といった分子的なレベルに
基づいて理解しようと言う学問が「分子生物学」です。
一方、生物(主に分子生物学)にかかわる情報を、コンピューターの
力を利用して解析し、意味を見出す、または、分子生物学の
実験を進めるための助けにしようというのが、
「バイオインフォマティクス」といわれる学問です。

従って、ゲノム配列情報を扱う技術そのものは、
バイオインフォマティクスですが、扱っているものの
意味を理解するためには、分子生物学の素養は必...続きを読む


人気Q&Aランキング