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制限酵素を使った実験を行いました。
多くの制限酵素は-20℃で保存されており、チューブに加える時も温度を上げないように注意されました。
しかし、最終的には37℃(酵素の至適温度)で反応させています。
制限酵素を加える時は温度を上げないように注意するのはなぜでしょうか?失活を防ぐためですか?しかし、それなら37℃では失活してしまうようにも思います。

また、次のような操作は可能でしょうか?
(1)チューブにDNA、制限酵素等を全て加えたところで中断して、-20℃で保存する。
(2)反応速度を上げるために、37℃で一時間のところを47℃で30分で行う。

どなたか教えて下さい。お願いします。

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A 回答 (3件)

>しかし、それなら37℃では失活してしまうようにも思います


そのとおり、徐々に失活します。ですから、インキュベーションは、1‐2時間、長くても一晩ですむように酵素量を調整するのです。各制限酵素がインキュベーションの条件で、何時間後にどれだけ活性を保持するかというような情報は、試薬会社のカタログにも出ています。

>制限酵素を加える時は温度を上げないように注意するのはなぜでしょうか
スター活性を防ぐためです。酵素は凍結防止のためグリセロール溶液で保存されて、反応液に加えても容易には拡散しません。一次的に酵素濃度と粘性が非常に高い部分ができ、非特異的な配列を切断する可能性があります。酵素を加えてよく混和するまで冷やして、反応が起こらないようにするのがよいのです。
>(2)反応速度を上げるために、37℃で一時間のところを47℃で30分で行う。
これも、スター活性の原因になり、非特異的な切断がおこる可能性があります。失活を早めることにもなります。

>(1)チューブにDNA、制限酵素等を全て加えたところで中断して、-20℃で保存する。

実際上は、いけるかもしれません。しかし、凍結してしまうと酵素は多かれ少なかれ失活するので、切断効率が起こることは覚悟しておかなければならないでしょう。
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この回答へのお礼

geneticist12さん、ありがとうございました。
わからなくてもやもやしていたのが、スッキリ解決です!

お礼日時:2005/04/23 22:06

制限酵素はグリセロール溶液中で保管されているため、-20℃では凍結しません。


(1)のご質問のようにチューブにDNAや制限酵素、必要試薬などを加えた後に-20℃にすると、チューブ内の反応液におけるグリセロールの比率が低下するため、凍結してしまいます。
通常、制限酵素は凍結により著しく失活するため、やめたほうがいいですよー。
(学生時代に経験済みです)
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この回答へのお礼

osarutさん、ありがとうございました。
再び凍結させておけば大丈夫なのかと思いきや、そうでもないんですね。
勉強になりました!

お礼日時:2005/04/23 22:10

#1です。



誤)切断効率が起こる
  ↓
正)切断効率が落ちる

しつれいしました。
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2.酵素の種類によっては、グリセロールで失活することもあるのでしょうか?

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よろしくお願いします。

Aベストアンサー

ザイモリアーゼをちょっと手元にある本で調べました。イーストのプロトプラスト調製に使う細胞壁分解酵素のようですね。メーカーのキロンビールに直接聞くのが一番正確で早く正解が得られると思いますよ。

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実験でプラスミドDNAの抽出をアルカリ法によって行いましたが、アルカリ法の原理がわかりません。
自分でも調べてみましたが、原理はわかりませんでした。
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Aベストアンサー

菌を適当なバッファーに再懸濁します(グルコースが入っているのが一般的ですが、浸透圧をあわせるだけで、あまり重要ではありません)。

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そこに酢酸カリウムなどの塩を加えると急激に中和されるのと同時に塩析作用で、タンパク質-SDS複合体と変性DNAを不溶化します(冷やすこと、時間を置くことで沈殿の形成を促します)。これを遠心分離すると上澄みにプラスミドが残ります。

塩を含んだ上澄みにアルコールを加えると溶けていたプラスミドがアルコール沈殿を起こすので、これを遠心分離して沈殿として回収します。70%程度のエタノールで沈殿から塩を洗い流します。

Q今度は・・制限酵素の失活についてなんですが。。。

毎回毎回すみません・・また実験がうまくいきませんでした・・・
プラスミドDNAをEcoRI,BamHIの二種類の制限酵素を使用し、どのように切断されるかをアガロース電気泳動を行って、バンドの移動度を比べてみました。
1つは、EcoRIだけで切断し、もう1つは二種類の酵素で切断しました。
でも電気泳動ででたバンドはネガコンとして流した未処理プラスミドDNAと同じバンドでした。通常移動度が遅くなったり、バンドが2本でるはずなのですが・・まったくありませんでした・・・
制限酵素が失活して、切断できなかったのではないかと考察したのですが・・・酵素は熱を加えると失活してしまうため温めないように注意したのですが・・
制限酵素が失活してしまう要因をどうか教えてください。実験で注意すべき点など教えていただければ今後の実験に役立ちます。ぜひ実験をして経験された事でもよいので教えてください。いつもいつも実験の失敗についてばかり質問してしまってすみません・・・
よろしくお願いします。

Aベストアンサー

先の「プラスミドDNAのい精製がうまくいきません・・・なぜ?」の質問内容と関連があると思いますので、まとめてここで。

1)ひょっとして、コンタミしていた偽者を精製したのではないでしょうか。大腸菌の増え方が殖えるのにいつもより時間がかかったとか、培養時間に比して菌の濃度が薄かったなどの兆候がありませんでしたか?

2)アルカリ処理が過剰で、プラスミドが変性したのかもしれません。大腸菌ゲノムが一本鎖に変性するけど、プラスミドが変性しないことでゲノムDNAが沈殿として取り除かれます。プラスミドまで変性してしまうと収量が悪くなります。また、プラスミドが部分的に変性してしまうことがありますが、そうなったら制限酵素が効かなくなります。アルカリ/SDS溶液の濃度、量、処理温度、時間は適当でしたか。

制限酵素は普通の保存、取り扱いでは失活することはほとんどありません。極端な話、室温で長時間放置しても大丈夫です。

Qプラスミド精製の原理

大腸菌からプラスミドを取り出す(精製)の
原理を簡単にいうとどんな感じですか?

今はキアゲンのキットを使っているので
いまいち原理がつかめません。
塩化セシウム、ボイル法とかありますが、
教科書を読んでもいまいちピンきません。

簡単に教えていただけませんか。

Aベストアンサー

1.大腸菌のサスペンションにアルカリ溶液を入れる
(大腸菌の膜が壊れて、タンパクやDNAなどが出てくる。DNAはアルカリで変性して一本鎖になる)

2.酸で中和する
(変性したタンパクなどは析出、長いゲノムDNAは中和で二本鎖に戻ろうするが、長いので絡まって析出。プラスミドDNAは小さいので二本鎖に戻って溶液中に存在)

3.遠心分離して上澄みを回収
(タンパクや絡まったゲノムDNAなどは沈殿、上澄みにあるプラスミドDNAを回収)

4.昔は(10年前の記憶だと)、フェノール・クロロホルムで、残りのタンパク質・脂質などを除く。
(脂質はフェノール層へ、DNA・RNAは水層へ、タンパク質は中間層へ分離するので、水層を回収)

5.その後、イソプロパノールでDNA・RNAを沈殿させる。(イソプロパノールでDNAの水和水が取られて、DNAが不溶化して沈殿する)

6・RNA分解酵素でRNAを分解して、もう一度フェノール抽出をして、エタ沈(イソプロと同じ原理)して、その沈殿を回収するとプラスミドDNAが得られる。

キアゲンは、4のところで、カラムにかけると、DNAが樹脂に結合するので、bufferで不要なものを洗い流して、最後にpHを変えると、プラスミドDNAは溶出されてきます。キアゲンのホームページからマニュアルをダウンロードすれば、詳しく書いてありますよ。

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Qエタノール沈殿での70%エタノールと100%エタノールの使い分け

エタノール沈殿をする際に、「70%エタノール」と「100%エタノール」を使用しますが、どうしてこの2種類の違う濃度のエタノールを使用するのか単純に疑問に思っています。
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70%エタノールと100%エタノールを使い分ける意味を知っている方がおられましたら、お暇な時で結構ですので教えて頂ければ幸いです。
よろしくお願い致します。

Aベストアンサー

エタノール沈殿の原理は省いて簡単に書きます。

DNAが塩析してくる最適なエタノール濃度が70%ほどであるのです。
通常、100%エタノールをもとの液の2~2.5倍ほど加えると思います。
すると最終的にエタノールの濃度は70%ほどになるはずです。

このように最終的に70%ほどの濃度にする、ということが目的なので
最初に加えるエタノールは100%じゃないとかなり面倒なことになると思いませんか?

そして洗浄のときですが、70%エタノールではDNAは溶けません。
もちろん100%エタノールにも溶けません。

ですが、エタノール沈殿における「洗浄」というのは、余計な塩を取り除くということです。
塩は水に溶けますが、アルコールには溶けません。
なんで、洗浄の時に100%エタノールを使っても塩を溶かし込んで覗けないということになります。
70%エタノールの30%は水であるということが重要なのです。
30%の水に塩を溶かして洗浄すると想像してください。

簡単なエタノール沈殿ですが、それぞれに意味があり、かつよく考えれられてデザインさているのです。

そういうことをきちんと理解して実験することは重要だと思います。

エタノール沈殿の原理は省いて簡単に書きます。

DNAが塩析してくる最適なエタノール濃度が70%ほどであるのです。
通常、100%エタノールをもとの液の2~2.5倍ほど加えると思います。
すると最終的にエタノールの濃度は70%ほどになるはずです。

このように最終的に70%ほどの濃度にする、ということが目的なので
最初に加えるエタノールは100%じゃないとかなり面倒なことになると思いませんか?

そして洗浄のときですが、70%エタノールではDNAは溶けません。
もちろん100%エタノールにも溶けま...続きを読む

Q酵素の失活

 制限酵素やTaqなど、酵素はいつも-20℃の冷凍庫に保存していますが、なぜ室温だと失活していくのですか?プロテアーゼで切られるにしても本当にピュアなものなら大丈夫だと思いますし、活性が変わるからにはどこかしら構造が変わっているように思っているのですが・・・失活するとは酵素が何によってどのように変化しているのかが知りたいです。
 また、逆になぜ-80℃の冷蔵庫には入れないのですか?ただ-20℃で十分でそれ以上は電気代が無駄なだけだとか?
 

Aベストアンサー

遺伝子操作自体は初心者なので、適切な答えになるか分かりませんが、
蛋白質構造の研究者としての考えも含めて・・・

まず一般的に酵素試薬は、グリセロールが入っているので-20℃でも凍らないようになっています。
しかし、さらに温度を下げると凍ってしまい(グリセロールの濃度によりますが、-40℃付近以下では凍り始めるようです)、凍結により力学的に酵素が変性させられるはずです。
ですから、酵素を-80℃ディープフリーザーで保存してはいけません。
(以前そんなことを知らなかった頃に、送られてきた酵素試料をディープフリーザーで保存して危うく凍らせるところでした・・・・師匠に厳重注意されました・・(汗))

基本的に温度を下げる理由は、熱による変性防止が主な理由でしょう。
ただ、Taqのように熱に強いはずの酵素までの低温保存するのは、
おそらく、他の酵素、菌のコンタミによる分解、および酸素による酸化、などの防止であると思います。

Q形質転換効率?の求め方

プラスミドの導入による細菌の形質転換のレポート作成中です。
形質転換効率(cfu/μg)求める式、どなたか教えていただけませんでしょうか??
また、プラスミドによる薬剤耐性化が問題となっている細菌感染症の例には、どのようなものがありますか??レポの提出日、明日なので、誰か助けてください><よろしくおねがいしますmm

Aベストアンサー

形質転換効率の意味を理解していれば、単純な割り算、掛け算です。特に公式のようなものはありません。
パラメータは
A. コロニーの数(プレーティングするを振っていたなら、数十から数百コロニーまいたプレートを採用します。少なすぎるとサンプリングによる振れが大きくなりますし、数えるのが不正確になります。同じ量をまいたプレートが複数ある場合は平均します)。

B. Aを与えたプレーティング細胞の体積
C. プレーティング細胞全体の体積(回復培養のため加えたSOC培地の体積でよろしい)
D. 使用したプラスミドベクターの重量(ライゲーション産物の場合はベクターの重量のみで、インサートは勘定にいれない)

計算例)
A=150 cfu, B=100 uL, C=1000 uL, D=1 ngとしましょう。

まいた100 uL中に含まれるプラスミド量は
1 ng x 100 uL/1000 uL=0.1 ng

そのプラスミド量で150個のコロニーが出たので、1 ugあたりに換算すると

150 cfu x 1 ug/0.1 ng= 150 cfu x 1 ug/0.0001 ug=1.5x10^6 cfu/ug

となります。単位につくmicro (uであらわしています), nano (n), pico (p)が順に1/1000ずつ小さいことをあらわすのは説明不用ですね。

薬剤耐性化の設問は、日常生活とのかかわりを問うているもので、専門知識よりむしろ新聞の社会欄に出てるような話題を求めているのではないですか。たとえば、院内感染で騒がれているのはどのような感染症でしょう。

形質転換効率の意味を理解していれば、単純な割り算、掛け算です。特に公式のようなものはありません。
パラメータは
A. コロニーの数(プレーティングするを振っていたなら、数十から数百コロニーまいたプレートを採用します。少なすぎるとサンプリングによる振れが大きくなりますし、数えるのが不正確になります。同じ量をまいたプレートが複数ある場合は平均します)。

B. Aを与えたプレーティング細胞の体積
C. プレーティング細胞全体の体積(回復培養のため加えたSOC培地の体積でよろしい)
D. 使用...続きを読む

QSDS電気泳動について教えて下さい。

SDS電気泳動ってどういうものなのでしょうか?
検索してみるとタンパク質の変性を加えて用いるということは分かったのですが、
それ以外のことは分かりません。
どなたか詳しい方教えて下さい。 

Aベストアンサー

まず、SDS電気泳動(多くの場合はSDS-PAGE, SDS-polyacrylamide gel electrophoresisと言います)をやる目的ですが、タンパク質をサイズの違いで分離する方法です。例えば、細胞の中にはかなりの種類のタンパク質があるため、何かの方法で分離して検出する必要があります。SDS-PAGEでは、この分離を「タンパク質のサイズ(タンパク質の長さ)の違い」で行います。

SDS-PAGEの原理ですが、
1.タンパク質をSDSで変性させる(タンパク質の立体構造が壊れる)
2.電気泳動でタンパク質をポリアクリルアミドゲルの「網目」を通過させる(大きいサイズほど流れにくく、小さいサイズのタンパク質は流れやすい)
というものです。網目を通過しやすいかしにくいかでタンパク質の長さを測定します。結果として、ゲルの下の方には小さいタンパク質が、上の方には大きいタンパク質がきます。

SDSで変性させる理由ですが、タンパク質を直鎖状にすることです。タンパク質はその機能を発揮するために特有の立体構造(疎水結合やジスルフィド結合などを利用して)を形成します。タンパク質をそのまま泳動すると、ポリアクリルアミドゲルの「網目の通りやすさ」はタンパク質の長さだけに影響されず、タンパク質の形状(立体構造)にも影響を受けます。

SDS-PAGEを行う場合の多くは、タンパク質の長さだけを知りたいので、タンパク質の立体構造に影響される電気泳動は望ましくありません。そこで、SDSでタンパク質を直鎖状にして電気泳動します。

では、SDSをいれるとなぜ、タンパク質が直鎖状になるか、です。SDSは親水基と疎水基の両方をもつ化合物です。そして、その親水基は負(マイナス)に荷電しています。

タンパク質の立体構造はアミノ酸残基(アラニン、グリシン、リジン、トリプトファン・・・)の性質(特にアミノ酸残基がもつ電荷)の影響を大きく受けます。SDSがタンパク質に作用すると、SDSの疎水基側がタンパク質に親水基側が溶媒側に結合します。このタンパク質に結合したSDSの親水基(マイナスに荷電)がタンパク質を構成する様々なアミノ酸の特性を打ち消してしまいます。結果として、SDSが結合したタンパク質はアミノ酸残基の影響をうけられなくなり直鎖状になります。

また、このようにSDSが結合したタンパク質はマイナスに荷電しますので、電気泳動をするとタンパク質(とSDSの複合体)はマイナスからプラスの方へ泳動されていきます。

最後に、立体構造に大きな影響を与えるジスルフィド結合に関してです。このジスルフィド結合はSDSによって壊されません。そこで、多くのSDS-PAGEを行う場合は、SDSと共に2-mercaptoethanolやDTTといったジスルフィド結合を壊す還元剤で処理したタンパク質を電気泳動します。

なお、立体構造も含めて解析したい場合は、Native PAGEと呼ばれる方法で電気泳動を行います。

まず、SDS電気泳動(多くの場合はSDS-PAGE, SDS-polyacrylamide gel electrophoresisと言います)をやる目的ですが、タンパク質をサイズの違いで分離する方法です。例えば、細胞の中にはかなりの種類のタンパク質があるため、何かの方法で分離して検出する必要があります。SDS-PAGEでは、この分離を「タンパク質のサイズ(タンパク質の長さ)の違い」で行います。

SDS-PAGEの原理ですが、
1.タンパク質をSDSで変性させる(タンパク質の立体構造が壊れる)
2.電気泳動でタンパク質をポリアクリルアミドゲ...続きを読む

Qエチジウムブロマイドについて

まったくの初心者なので・・・・・。
泳動後のゲルの染色についてお尋ねしたいのですが、
アガロースゲルでDNAを泳動した後、エチジウムブロマイドで染色しようと思っています。その時のエチジウムブロマイドの適当な濃度と染色時間を知りたいです。本によって濃度が 様々であり 困ってます。
誰か教えて下さい。宜しくお願いします。

Aベストアンサー

kimwipeさんとdora1さんとほぼ同様です。私は後染めですが、EtBrは10mg/mlで遮光室温でストックしており、水200mlに2mlを加えています。別に用事調整ではなく、何度か使いまわしています(捨てるのに手間がかかりますので)。5分程度シェーカーの上で置いて、その後数回水洗いです。写真を撮る場合、キムワイプ等で水気を切ってから撮っています。ただ、すぐに撮るとバックが強く出る感じがあるので、10分程度おいてから撮っています。ただし、置きすぎるとバンドがぼけます。kimwipeさんがおっしゃるとおり、ゲルにあらかじめEtBrを加えておくと、きれいにバンドが染まるし、泳動中にUVで確認できますが、EtBrが陰極か陽極側に(忘れました)寄るので、ゲルの濃度とバンドの位置によってはバンドとバックが重なるかもしれません。

Qサテライトコロニー?について

こんばんは。
初めて質問します。よろしくお願いします。

大腸菌のトランスフォーメーション実験を行い、アンピシリンとX-gal染色によりセレクションしました。
白色コロニーをコロニーPCRにかけるために選ぶ際、指導者に、サテライトコロニー(?)は白色でも正しくトランスフォーメーションされていないことが多い、と言われました。
サテライトコロニーとは、1つの大きなコロニーのまわりに小さな飛び散ったようなコロニーが見えるもののことを指すらしいのですが。
なぜ、正しくトランスフォーメーションされていないのでしょうか?確かにコロニーPCRでは増幅されませんでした。
指導者はその理由は忘れてしまったそうです(-_-メ)
調べても中々わかりません。
どなたかご存知でしたら教えてください。
参考URLでもかまいません。
よろしくお願いします。

Aベストアンサー

サテライトコロニーは、形質転換体のコロニーによって、培地中の薬剤が分解されたために、形質転換されていない(つまり、プラスミドを持っていない)ものがコロニーを形成してしまう現象です。

プラスミド自体を持っていないので、β-ガラクトシダーゼ活性も持ちませんから、コロニーの色は白色となります。

ちなみに、サテライトコロニーは、アンピシリン耐性で選抜するときによく見られますが、アンピシリンの代わりにカルベニシリンという薬剤を使うと、サテライトコロニーの発生をかなり抑えられます。(カルベニシリンは、アンピシリンと比べるとかなり高価ですが。)


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