マンガでよめる痔のこと・薬のこと

今コンピテントセルを作っているのですが、そこで大腸菌を培養するSOB培地の組成の意味を知りたいです。
培地に詳しい方ご教授ください。

1.カゼインペプトン
   細菌の栄養源?
2.NaCl
塩濃度を保つ為
3.Yeast Extract
4.2M KCl
5.1M MaCl2
6.NaOH
PH調整?

臨床微生物を学生時代やりましたが、分子生物の分野に来てSOBは初めて使います。教科書にのっていなくて困ってます。
他はなんとなく予想がつくのですが、3~5がさっぱりです。宜しくお願いします。
また、DMSOを後に入れる意味も分かりましたらお願いします。

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A 回答 (1件)

こんにちは。


判る範囲ですが・・

1:カゼインペプトン 細菌の栄養源です。窒素源で 
 す。
3:yeast extract 細菌の栄養源です。アミノ酸・ビ
 タミンを含みます。
5:MgCl2 大腸菌の膜に穴をあけてDNAの透過性をアッ プさせます。
6:NaOH 書かれているとおりpHの調節です。
2,4:自信はないですが、塩濃度の調節だと思います。

DMSOをいれる理由は作成したコンピテントセルを凍結保存する際の薬品では?
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この回答へのお礼

ありがとうございました。
DMSOは凍結保存する際の細菌の変性防止といったところでしょうか。
助かりました!

お礼日時:2005/07/08 13:43

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Q形質転換効率?の求め方

プラスミドの導入による細菌の形質転換のレポート作成中です。
形質転換効率(cfu/μg)求める式、どなたか教えていただけませんでしょうか??
また、プラスミドによる薬剤耐性化が問題となっている細菌感染症の例には、どのようなものがありますか??レポの提出日、明日なので、誰か助けてください><よろしくおねがいしますmm

Aベストアンサー

形質転換効率の意味を理解していれば、単純な割り算、掛け算です。特に公式のようなものはありません。
パラメータは
A. コロニーの数(プレーティングするを振っていたなら、数十から数百コロニーまいたプレートを採用します。少なすぎるとサンプリングによる振れが大きくなりますし、数えるのが不正確になります。同じ量をまいたプレートが複数ある場合は平均します)。

B. Aを与えたプレーティング細胞の体積
C. プレーティング細胞全体の体積(回復培養のため加えたSOC培地の体積でよろしい)
D. 使用したプラスミドベクターの重量(ライゲーション産物の場合はベクターの重量のみで、インサートは勘定にいれない)

計算例)
A=150 cfu, B=100 uL, C=1000 uL, D=1 ngとしましょう。

まいた100 uL中に含まれるプラスミド量は
1 ng x 100 uL/1000 uL=0.1 ng

そのプラスミド量で150個のコロニーが出たので、1 ugあたりに換算すると

150 cfu x 1 ug/0.1 ng= 150 cfu x 1 ug/0.0001 ug=1.5x10^6 cfu/ug

となります。単位につくmicro (uであらわしています), nano (n), pico (p)が順に1/1000ずつ小さいことをあらわすのは説明不用ですね。

薬剤耐性化の設問は、日常生活とのかかわりを問うているもので、専門知識よりむしろ新聞の社会欄に出てるような話題を求めているのではないですか。たとえば、院内感染で騒がれているのはどのような感染症でしょう。

形質転換効率の意味を理解していれば、単純な割り算、掛け算です。特に公式のようなものはありません。
パラメータは
A. コロニーの数(プレーティングするを振っていたなら、数十から数百コロニーまいたプレートを採用します。少なすぎるとサンプリングによる振れが大きくなりますし、数えるのが不正確になります。同じ量をまいたプレートが複数ある場合は平均します)。

B. Aを与えたプレーティング細胞の体積
C. プレーティング細胞全体の体積(回復培養のため加えたSOC培地の体積でよろしい)
D. 使用...続きを読む

Qサテライトコロニー?について

こんばんは。
初めて質問します。よろしくお願いします。

大腸菌のトランスフォーメーション実験を行い、アンピシリンとX-gal染色によりセレクションしました。
白色コロニーをコロニーPCRにかけるために選ぶ際、指導者に、サテライトコロニー(?)は白色でも正しくトランスフォーメーションされていないことが多い、と言われました。
サテライトコロニーとは、1つの大きなコロニーのまわりに小さな飛び散ったようなコロニーが見えるもののことを指すらしいのですが。
なぜ、正しくトランスフォーメーションされていないのでしょうか?確かにコロニーPCRでは増幅されませんでした。
指導者はその理由は忘れてしまったそうです(-_-メ)
調べても中々わかりません。
どなたかご存知でしたら教えてください。
参考URLでもかまいません。
よろしくお願いします。

Aベストアンサー

サテライトコロニーは、形質転換体のコロニーによって、培地中の薬剤が分解されたために、形質転換されていない(つまり、プラスミドを持っていない)ものがコロニーを形成してしまう現象です。

プラスミド自体を持っていないので、β-ガラクトシダーゼ活性も持ちませんから、コロニーの色は白色となります。

ちなみに、サテライトコロニーは、アンピシリン耐性で選抜するときによく見られますが、アンピシリンの代わりにカルベニシリンという薬剤を使うと、サテライトコロニーの発生をかなり抑えられます。(カルベニシリンは、アンピシリンと比べるとかなり高価ですが。)

Qグリセロールストックについて?

学生時代、大腸菌をグリセロールストックすると保存状態が良く長期間保存できる?という事をを教わったような記憶があります。なぜ普通に凍結するより状態が良いのでしょうか?理由とグリセロールストックの操作方法を教えて下さい。又、大腸菌以外の微生物にも有効なのでしょうか?教えて下さい。お願いします

Aベストアンサー

細菌類ならなんでもできると思います。
細菌を培養した液を保存用の小さいチューブに移し、グリセロールを加えて冷凍し(液体窒素やドライアイスなどで急速冷凍するのが望ましい)、マイナス80℃のフリーザーで保存します。半永久的に保存できます。グリセロール濃度はものの本や各メーカーから提供される形によって15-50%と幅がありますが、濃度が低めのほうが再融解しにくく持ちが良いように感じます。
使用するときは、凍結したまま少量を削り取って培地にまきます。

ちなみに、生物学研究で用いられるモデル生物のひとつ、線虫もグリセロールストックします。

Q脱イオン水、MilliQ、蒸留水 の違いを教えて下さい

こんにちは。お世話になります。

バイオ、生化学系の実験に従事しているものですが「水」について教えて下さい。

水道水、脱イオン水、MilliQ、蒸留水(二段蒸留水)、超純水の違いを教えて下さい。
お互いの関係などありましたら(○○を~すると△△になる等)教えていただけると
わかりやすいかもしれません。

また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?

よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は除けません。

蒸留法は水を蒸留することで不純物を除く方法です。イオン交換法と組み合わせて2回蒸留することが一般的です。一般的な2次蒸留水の比抵抗は数MΩ・cmでバイオ・生化学関係には十分な純度です。動物培養細胞にも使用可能です。エンドトキシンも完全にフリーとまではいかないけれどもある程度の除去はできています。蒸留法は多くの不純物を除去可能ですが100度付近の沸点を持つ物質は除けません。

逆浸透法は半透膜に圧力をかけて精製する方法です。

限外濾過法は限外濾過膜を通す方法です。孔径は半透膜が数十nmに対し、限外濾過膜は数nmです。それゆえ、数kDa以上の分子であれば、限外濾過法で除けますので、エンドトキシンやRNaseなども除去できます。本当にエンドトキシンフリーな水が必要でしたら限外濾過法を行った水が必須です。ただ、普通のCOSとかHEKとかの動物細胞培養でしたら2次蒸留水でも十分です。蛍光検出用のマイクロアレイなんかは限外濾過水が必須なようです。

超純水は十数MΩ・cmの水のことです。MilliQはミリポア社の超純水装置を用いて作った水で比抵抗は15MΩ・cm以上と高純度の水です。MilliQに関してはイオン交換樹脂を通し、逆浸透法、限外濾過法を用いて精製しているようです。

>また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
これに関しては上で書いたように限外濾過膜で精製した水です。MilliQが当てはまるでしょう。(超純水も一般的には限外濾過をしているのでこれも当てはまりますかね。)

>動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?
これは、2次蒸留水以上の純度があれば十分です。2次蒸留水、MilliQ水、超純水が使用できます。

ただ、水関係の装置は日頃のメンテナンスが重要でイオン交換樹脂とか水を貯めるタンク、蛇口に汚染がないかは確認する必要があります。

実験書には必ずはじめのほうに書いてあることですので、pinokoBBさん自身でなにか実験書をご参照ください。

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は...続きを読む

Qヒートショックをするのには何か意味があるのでしょうか??

コンピテントセルにプラスミドDNAを取り込む実験をしていますが、極端に冷却した後、ヒートショックという過程があることをしりました。
ヒートショックをすることには、何か意味があるのでしょうか??
コンピテントセルが脆くなってDNAがさらに取り込まれやすくなったりとかするのでしょうか??

Aベストアンサー

基本的な思い違いをなされていると思います。ヒートショックによりプラスミドがコンピテントセル内に取り込まれるんです。そのため、その前段階のメルカプト添加や冷却などはコンピテントセル表面にプラスミドをくっつけヒートショックにより取り込ませやすくするための前準備という考え方が正しいです。
詳しい原理は微生物の知見がないと難しいので、脊椎動物などの遺伝研究を行っている方は意外と原理を知らなかったりします。興味があれば調べてみるといいですよ。

Qプラスミド精製の原理

大腸菌からプラスミドを取り出す(精製)の
原理を簡単にいうとどんな感じですか?

今はキアゲンのキットを使っているので
いまいち原理がつかめません。
塩化セシウム、ボイル法とかありますが、
教科書を読んでもいまいちピンきません。

簡単に教えていただけませんか。

Aベストアンサー

1.大腸菌のサスペンションにアルカリ溶液を入れる
(大腸菌の膜が壊れて、タンパクやDNAなどが出てくる。DNAはアルカリで変性して一本鎖になる)

2.酸で中和する
(変性したタンパクなどは析出、長いゲノムDNAは中和で二本鎖に戻ろうするが、長いので絡まって析出。プラスミドDNAは小さいので二本鎖に戻って溶液中に存在)

3.遠心分離して上澄みを回収
(タンパクや絡まったゲノムDNAなどは沈殿、上澄みにあるプラスミドDNAを回収)

4.昔は(10年前の記憶だと)、フェノール・クロロホルムで、残りのタンパク質・脂質などを除く。
(脂質はフェノール層へ、DNA・RNAは水層へ、タンパク質は中間層へ分離するので、水層を回収)

5.その後、イソプロパノールでDNA・RNAを沈殿させる。(イソプロパノールでDNAの水和水が取られて、DNAが不溶化して沈殿する)

6・RNA分解酵素でRNAを分解して、もう一度フェノール抽出をして、エタ沈(イソプロと同じ原理)して、その沈殿を回収するとプラスミドDNAが得られる。

キアゲンは、4のところで、カラムにかけると、DNAが樹脂に結合するので、bufferで不要なものを洗い流して、最後にpHを変えると、プラスミドDNAは溶出されてきます。キアゲンのホームページからマニュアルをダウンロードすれば、詳しく書いてありますよ。

1.大腸菌のサスペンションにアルカリ溶液を入れる
(大腸菌の膜が壊れて、タンパクやDNAなどが出てくる。DNAはアルカリで変性して一本鎖になる)

2.酸で中和する
(変性したタンパクなどは析出、長いゲノムDNAは中和で二本鎖に戻ろうするが、長いので絡まって析出。プラスミドDNAは小さいので二本鎖に戻って溶液中に存在)

3.遠心分離して上澄みを回収
(タンパクや絡まったゲノムDNAなどは沈殿、上澄みにあるプラスミドDNAを回収)

4.昔は(10年前の記憶だと)、フェノール・クロロホルム...続きを読む

Qエタノール沈殿での70%エタノールと100%エタノールの使い分け

エタノール沈殿をする際に、「70%エタノール」と「100%エタノール」を使用しますが、どうしてこの2種類の違う濃度のエタノールを使用するのか単純に疑問に思っています。
別に70%エタノールで洗浄して、もう一度70%エタノールで洗浄してもいいと思いますし、逆に両方とも100%エタノールでもいいのではないかと素人の私は思ってしまいます。
70%エタノールと100%エタノールを使い分ける意味を知っている方がおられましたら、お暇な時で結構ですので教えて頂ければ幸いです。
よろしくお願い致します。

Aベストアンサー

エタノール沈殿の原理は省いて簡単に書きます。

DNAが塩析してくる最適なエタノール濃度が70%ほどであるのです。
通常、100%エタノールをもとの液の2~2.5倍ほど加えると思います。
すると最終的にエタノールの濃度は70%ほどになるはずです。

このように最終的に70%ほどの濃度にする、ということが目的なので
最初に加えるエタノールは100%じゃないとかなり面倒なことになると思いませんか?

そして洗浄のときですが、70%エタノールではDNAは溶けません。
もちろん100%エタノールにも溶けません。

ですが、エタノール沈殿における「洗浄」というのは、余計な塩を取り除くということです。
塩は水に溶けますが、アルコールには溶けません。
なんで、洗浄の時に100%エタノールを使っても塩を溶かし込んで覗けないということになります。
70%エタノールの30%は水であるということが重要なのです。
30%の水に塩を溶かして洗浄すると想像してください。

簡単なエタノール沈殿ですが、それぞれに意味があり、かつよく考えれられてデザインさているのです。

そういうことをきちんと理解して実験することは重要だと思います。

エタノール沈殿の原理は省いて簡単に書きます。

DNAが塩析してくる最適なエタノール濃度が70%ほどであるのです。
通常、100%エタノールをもとの液の2~2.5倍ほど加えると思います。
すると最終的にエタノールの濃度は70%ほどになるはずです。

このように最終的に70%ほどの濃度にする、ということが目的なので
最初に加えるエタノールは100%じゃないとかなり面倒なことになると思いませんか?

そして洗浄のときですが、70%エタノールではDNAは溶けません。
もちろん100%エタノールにも溶けま...続きを読む

Qアンピシリンの失活温度について

アンピシリンの失活温度について教えてください。

LB(Amp)のプレート培地を作製する時にいつも思うことです。

オートクレーブ後の三角フラスコに入っているLB培地に、いつアンピシリンを添加すればいいのかわかりません。

僕の場合は、三角フラスコをクリーンベンチ内で両手で触って円を描くように揺らしてみて、手をつけてられる熱さまで冷ましてから入れるようにしています。

宜しくお願いします。

Aベストアンサー

私も学部生の頃に同じことを考えましたが。。。結論は結構微妙なところだと思います。アンピシリンは酵素のように高温になると変成していっぺんに失活する訳ではなく、高温になるほど分解の進みが早くなるわけですよね。(もちろん1時間くらい煮沸すればかなり失活するかもしれませんが。。)。というわけで、結局実験的にできるだけ影響が起きない(しかし、ゲルが固まらない)ような妥協点の温度でやるために手で触れる=約60℃で添加することがスタンダードになってるわけです。

Qプラスミドの大量調製

題字の如くなのですが、プラスミドの大量調製が思いのほかうまくいきません。培養の際の培地を500mlないし1lで大腸菌を増やしているのですが、大腸菌自体はばかばか増えるのに、そこから得られるプラスミドが10μgくらいしかありません。low-copy plasmidかとも疑い、培地の量をかえてトライもしてみましたが、こちらでもうまくいかないんです。
培地には抗生物質を添加しているので、プラスミドを持たない大腸菌が急増するということは考えにくいですし、やはり細胞内でのコピー数が少ないと考えています。
このようなプラスミドの収量を上げるには、どうすれば良いでしょうか?具体的な数字で表すと、100μgは取れるといいのですが。
何か工夫すべき点がありましたら、ご教授願います。

Aベストアンサー

まず、プラスミドの骨格は何でしょうか。
low-copyかどうかは普通は疑うのではなく調べるものです。
プラスミドのoriが何由来なのかを調べれば大体のコピー数と収量がわかります。
http://www.promega.co.jp/cat/technical/17-q.html
P1 phage由来のPACベクターに大きいインサートが入っていれば1l培養しても10ugしか取れないということはあります。

それと、1mlで培養した時にはどのくらい取れるのでしょうか。
たいてい少量のスケールで精製したもののほうがml当たりの収量はいいです。
大量培養した時にもそこから1mlとってちゃんと増えていることを確認したほうがいいかとおもいます。

実際の大量調整の時にはどの方法を使ってどのスケールでやっているのでしょうか。
アルカリSDS法かその変法のキットを使っていると思いますが、
ちゃんとリシスしているのか誰かわかる人に確認してもらったほうがいいと思います。
大腸菌が壊れていなければプラスミドは出てこないでペレットとして捨てられることになります。

抗生物質の濃度は適当なのでしょうか。場合によっては2倍くらいにしたほうが収量がよくなることがあります。

もしかりにlow-copyのプラスミドならば
途中でクロラムフェニコールを加えることにより大腸菌の増殖を止めてコピー数を増やすことができることがありますが、
コピー数が少ないプラスミドをわざわざ使っている時には、コピー数が増えると組換えを起こすようなインサートが入っていることがあるので
事前に調べておく必要があります。

まず、プラスミドの骨格は何でしょうか。
low-copyかどうかは普通は疑うのではなく調べるものです。
プラスミドのoriが何由来なのかを調べれば大体のコピー数と収量がわかります。
http://www.promega.co.jp/cat/technical/17-q.html
P1 phage由来のPACベクターに大きいインサートが入っていれば1l培養しても10ugしか取れないということはあります。

それと、1mlで培養した時にはどのくらい取れるのでしょうか。
たいてい少量のスケールで精製したもののほうがml当たりの収量はいいです。
大量培養した...続きを読む

Qコンピテントセル作製で

この時使用するTB bufferの中には、大抵塩化マンガンが含まれていますが、何故塩化マンガンが必要なのでしょうか?
通常、塩化カルシウム法を用いる場合、TB bufferを使用せず、塩化カルシウム溶液だけでもコンピテントセルの作製が可能とのことですので、塩化マンガンをわざわざ添加するということは、私なりに疑問に感じています。
どなたかご存じの方、よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

Hanahanを始め先人たちが、いかにすればプラスミド導入効率を高くできるか、いろいろ条件を検討した経験則としか言いようがないのではないでしょうか。そもそもMnに限らず、CaにしろRbにしろ、どのようなメカニズムで大腸菌にcompetenceを与えるのかも、はっきりとはわかっていないのですから(一説によると、大腸菌表面のリポポリサッカライドとDNAをくっつけるのに二価金属イオンが効いているのだとか)。
http://www.ias.ac.in/currsci/dec102002/1376.pdf

20年ほど前には、私もCaCl2だけで形質転換をしていました。確かにできます。でも、後々一般化した様々な改良法に比べると、形質転換効率やcompetenceの安定性、保存性は比べものにならないほど悪いですよ(たとえば、作ったcompetent cellはその日の内しか使い物にならない、凍結保存すると形質転換効率ゼロとか)。


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