ウエスタンブロットを行い、メンブレンに転写し、ブロッキングしたあと、
フィルムに感光してバンドを確認してるのですが、その際、バックグラウンドが
濃くなり、バンドがきれいに見えません。何かいい方法はないでしょうか。
メンブレンのメーカーや種類が関係してるのでしょうか?メンブレンはニトロセルロースで、アドバンテックを使用してます。
よろしくお願いします。

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A 回答 (4件)

いくつかあげてみますので興味があれば試してください。


バックが高くて真っ黒になってしまうのですよね?

1.ブロッキングの濃度を上げる。
2.2次抗体の濃度を減らす。
3.2次抗体の反応時間を短く。
4.1次抗体を4度でオーバーナイト。
5.高いけど一部のモノクロで売られているHRPつきのものを使う。
6.ウォッシュの回数と液量を増やす。
7.2次抗体の前にもう一度ブロッキングを入れる。
8.ECL+つかっているならECLに変える。感度は下がるが見えるものは見える。

まだまだありそうですがとりあえず。
実用的なものから、そんなに効果が望めないものまであります。
順番は関係ないです。

2,3,5,8あたりは試しても良いかもしれません。

個人的にはPVDFよりニトロセルロースでバックが少ない気がします。
クルードサンプル、免沈サンプルだとどうしても汚くなります。
検出限界まで量を減らしてバックを減らすこともありますがというていど。

研究にさわりのない程度の情報を書いてくだされもう少し絞れるかもしれません。

この回答への補足

ブロッキングの濃度は、5%スキムミルク
2次抗体は1000倍で、室温1時間インキュベートしてます。
ウオッシュはPBSで10min3回程度です。
初歩的な質問かもしれませんが、ECLとは何ですか?

補足日時:2001/10/18 19:16
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まだ回答を締め切っていないので補足です。



メンブレン染めるときは、NCならCBBはだめですよ。
溶けます。たまにやっちゃう人がいます。

ポンソーSで染めましょう。長期保存にはCBBがよいです。
PVDFなら大丈夫。

私はうまくいかなかったときのチェックのために
ゲルも残しておいておかしいときは染めます。

メンブレンも明らかな時以外は染めるようにしています。
(手間でないから)

できるだけ原因は詰められるようにしておきましょう。

あと回答も適当なところで締めてね。
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ECLについては参考ページを参照してください。



WashにTween 20は入れてないのですか?
私はファイナル0.05%で入れてます。
TBSを使っていますが変わらないと思います。

参考ページにいろいろいろありますのでそちらも参考に。

経験ですが、メンブレンをあとで染色してみて、レーンが
塗りつぶされているほどタンパクをのせているとどうしても
黒くなります。検出できるならばタンパクを減らすことでバックは落とせます。
バンドがラダーに見えているぐらいまでならほとんどバックなしです。
長焼きすると黒くなりますけどね。

何かありましたらまたどうぞ。

参考URL:http://www.jp.apbiotech.com/products/kouryaku/Ch …
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この回答へのお礼

いろいろありがとうございました。
早速、やってみます。
メンブレンを染色するのはいい方法ですね。
また、他の実験もしてるので何かありましたら
聞くと思います。
ありがとうございました。

お礼日時:2001/10/19 22:15

今はニトロセルロースより、PVDF膜が一般的なのではないでしょうか。


ニトロセルロースの使用経験はありませんが、
バックが高く、膜の強度が弱いということを聞いたことがあります。
バンドの出るべき高さはわかっているのでしょうか?
もし、メインの出るべきバンドがあるなら、
露光時間の調整だけで対処できる可能性はあると思います。
もう少し情報(状況)を追加してください。

この回答への補足

ブロッキングの濃度は、5%スキムミルク
2次抗体は1000倍で、室温1時間インキュベートしてます。
ウオッシュはPBSで10min3回程度です。
認識バンドは30kD付近です。

補足日時:2001/10/18 19:23
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Q古いウエスタン映画のタイトルが知りたい

少年の頃TVで観たウエスタン映画が忘れられません。
どなたかタイトルを教えてください。

何かの理由で夫を殺され、自分もレイプされたあと家を焼かれた女性が、
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というようなストーリーだったと思います。

ガンマンの修行で手首を鍛えるために、重い石をヒモで棒にぶらさげ、
両手を前に伸ばして棒を握り、クルクルと巻き取っていくシーンがとても
印象的でした。 何回もやらされ、一息ついた彼女が、
「次は何をするの?」というと、
男が黙って石を大きなものに変えてしまいました・・・

不幸のどん底に突き落とされた女性が、殺し屋の助けを借りて復讐をとげる・・
考えてみれば「レオン」と同じストーリーですよね。
悪役はゲイリー・オールドマンのようなインパクトはなく、
ただの下品な悪党だったような。(笑)

最後にどうなったのかよく覚えていませんので、できればもう一度観たいです。

よろしくお願いします。

Aベストアンサー

「oldnick6666」さんのご質問を読んで、
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で、どうやらラクエル・ウェルチの
「女ガンマン・皆殺しのメロディ」という本邦未公開のイギリス映画のようです。

http://www.allcinema.net/prog/show_c.php?num_c=3959

ストーリーからすれば間違いないと思いますが、
強いて相違点をあげれば、悪役がアーネスト・ボーグナインはじめ、
けっこうインパクトのある連中であることぐらいです。
DVD出てるようですので、ご確認あれ。

Qウエスタンブロットのメンブレンの保存方法を教えてください!

ウエスタンブロットをしています。後でリプローブをしたく、メンブレンを保存したいのですが、どのように保存するのがいいのでしょうか?
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よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

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Q古いウエスタン映画のタイトルが知りたい(Part2)

これも少年のとき見たウエスタン映画です。
軍隊や悪党たちを出し抜き、どこかに隠された金貨(盗まれた軍資金?)を
手に入れるため、6人だったか7人だったかの仲間が協力して西部の荒野を駆け回る映画でした。

リーダーが集めたのは、爆弾の専門家・人間離れした運動神経の持ち主・早撃ちの名手などで、
とても魅力的な仲間たちが登場していました。

爆弾の専門家は、バンジョー型の榴弾発射機を使って派手に爆破しまくります。
彼が軍隊の基地へ潜入するために給水車に隠れていたとき、火薬が濡れないように
水筒に詰め、水に潜っていました。 水の補給を心待ちにしていた兵隊が、彼の
隠れている給水車の蓋を開け、片手で水をすくって飲み、
「くそっ 妙な味がしやがる」
と悪態をついたのを記憶しています。

身軽な早撃ちガンマンの運動神経は、本当に並外れていて、ロード・オブ・ザ・リングの
エルフよりカッコよかったです。 その彼が軍隊の基地でついに背中を撃たれ、
彼を置いて脱出した馬車を追ってよろよろとゲートに向かいますが、丸太でできた
扉が目前で閉まり、それでも彼は丸太に顔を喰い込ませて馬車の去った方向を
にらみ続けていました・・・

寄せ集めのグループが、裏切りと疑心暗鬼を乗り越えて金貨を手に入れようとしますが、
最後の最後まで誰が勝者かわからず、デッドヒートの末生き残った一人が金貨を
手に入れるというストーリーで、あまりに印象的なシーンが多く、ぜひもう一度
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よろしくお願いします。

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「五人の軍隊」ではないでしょうか。
こういう質問の場合、「子供の頃」とか「少年のとき」ではなく、○○年ごろとか○○年前とか書いたほうがいいと思いますよ。
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どうしても分かりません。よろしくお願いします。

Aベストアンサー

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今度ミュージカルをする際に、子供たちにウエスタンファッションをさせるのですが、資料がありません。
カウボーイ、カウガール的なもので結構ですので、ウエスタンファッションののっているサイトや映画などご存知の方おられましたら、教えて下さい!
どうぞ宜しくお願いします☆

Aベストアンサー

こんにちは。
ウエスタンファッションで子供達がミュージカル…!
想像するだけでとっても可愛らしいですね♪
GOOGLEイメージ検索で、検索をかけてみたら如何でしょうか?
日本のサイトだとなかなか探しづらいかもしれませんので、
『western』等で検索し、海外のサイトを見てみると参考になるかもしれませんね。

ウエスタン映画は余り観ないのですが、
ディズニーの『TOY STORY 2』では
カウボーイ・カウガールファッションが見れます。

以下は学芸会等を想定して書かせて頂きます。

色々そろえるのは大変だと思うので、
個人的には『テンガロンハット&ジーパン』で充分かと思います。
女の子はデニムのスカートにウエスタンブーツが
とても可愛いですが、
トイストーリーに出てくるカウガールは、ジーパンでも充分可愛かったです。
あとは首にバンダナを結んでみたりすれば更に可愛いですね。
テンガロンハットは、わざわざ買わなくても
普通の帽子の左右を上に持ち上げて固定すれば
何となくテンガロンに見えます。

本格的なミュージカルならば、大変失礼いたしました。

いや~、本当に可愛いだろうなぁ。
何だか楽しんで回答させてもらってしまいました。

参考URL:http://images.google.co.jp/imghp?hl=ja

こんにちは。
ウエスタンファッションで子供達がミュージカル…!
想像するだけでとっても可愛らしいですね♪
GOOGLEイメージ検索で、検索をかけてみたら如何でしょうか?
日本のサイトだとなかなか探しづらいかもしれませんので、
『western』等で検索し、海外のサイトを見てみると参考になるかもしれませんね。

ウエスタン映画は余り観ないのですが、
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以下は学芸会等を想定して書かせて頂きます。

色々そろえるの...続きを読む

Qウエスタンブロットについて

質問させてくださぃ!!

ウエスタンブロットの
ブロッキング→1次抗体をつける→2次抗体をつける
という流れを詳しく教えてほしいです。
ブロッキングはスキムミルクをT-TBSに溶かしたものをタッパーに入れて揺らしたらいいんでしょうか??
1次抗体はラップを引いてその上に1次抗体とキャンデットシグナルをたらしメンブレンをつけるので合ってますか??
2次抗体はどのようにつけるのでしょうか??

間に挟むWASHについても教えてほしいです。

よろしくお願いします!!!

Aベストアンサー

ブロッキングは5%スキムミルクや5%BSAが一般的かと思いますが、抗体によります。抗体の説明書に何か書いてあればそれに従ってください。リン酸化抗体などの場合はスキムミルクは避けた方がいい場合もあります。
T-TBSはTBS+Tween20のことでしょうか。ブロッキングはその方法でOKです。
「キャンデットシグナル」というのは聞いたことがないのですが増幅剤か何かですか? 1次抗体も2次抗体も、ブロッキングと同じようにタッパーか何かに入れて揺すればよいです。ただ、その場合必要な抗体溶液が多くなってしまいますので、減らしたければハイブリバッグなどを使うといいでしょう。ラップに付けただけだと抗体の反応ムラが出るかもしれません。
抗体反応後の洗浄はタッパーに入れて揺すりながらT-TBSで5分x3回くらい行ってください。

Qガンプレイが見れる映画

映画ファンの皆さんへ質問です

私は、西部劇やマカロニウエスタン(古っ!)で
ガンプレイ(拳銃をくるくる回すやつ)や
早撃ちを見るのが大好きです。

どなたかそれらを十分に堪能出来る映画がありましたら
教えてください。(年代は問いません)
出来ればレンタルしているものを教えてください。
どうぞ宜しくお願いいたします。

Aベストアンサー

ちょっと古いですが、テレンスヒル主演の「ミスターノーボディ」なんかどうでしょう。
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後はブルースウィリスの「ラストマンスタンディング」。
用心棒の再映画化したものですが、クライマックスの撃ち合いは理屈抜きにして面白いです。

すさまじいばかりの撃ち合いですと、ペキンパー監督の「ワイルドバンチ」。
恐ろしいほど撃ち合います。

先込め式の拳銃使った「アウトロー」もかっこいいです。
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書き出すときりがないのでとりあえずこの当たりで。
失礼しました~~。

Qウエスタンブロットと免疫染色について

同じ抗体と細胞を用いて、ウエスタンブロットと免疫染色をした場合に、ウエスタンブロットで反応があっても、免疫染色では反応が見られないなどということが起こったりするのでしょうか??ご存知の方がいらっしゃったらぜひ教えてください。

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そんなことはよくあります。
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どのメーカーの抗体表を見てもWB、IP、ICなどどのような実験に用いることができるかが書いてあります。WBはできてもIP、ICができないものは結構多いですよ。

Q映画「シェーン」の主人公は死にましたか?

映画「交渉人」の中で、ウエスタン好きの男が、
映画「シェーン」のラストシーンで、去って行く主人公はすでに死んでいる、
全く動かないのが証拠だ、と力説する場面が二度あります。
シェーンは死んでいるのでしょうか?
そもそも弾に当ったという記憶がないのですが。

よろしくお願いします。

Aベストアンサー

昔から論争のあったネタですね。日本の映画ファンの間でだけかと思っていましたのですが、『交渉人』でも同じやりとりがあったので、“アメリカでも同じ論争があるのだな~”と思いました。

>そもそも弾に当ったという記憶がないのですが。

ウィルソン(殺し屋)もストレーカー(敵の親玉)も、まともにシェーンに向けて発砲はできていませんが、3番目の男が2階のバルコニーからショットガンで撃ったときには弾が当たった可能性があるように見えます。というか、よく見ますとアラン・ラッドは「撃たれた!」という演技をしていますよ。左の肩から脇腹あたりに痛みを感じているという動作になっています。
その後、去っていくまでずっとシェーンは左腕をぶらぶらさせたままでいます。
ジョーイ(少年)のセリフでも“シェーン、血が出てる”というのがありますので、撃たれたことに間違いはないでしょう。映像として血が出ていないのは当時の映像表現における'品'の問題だと思います。

(最大の問題は、別れ際にシェーンは'左手でジョーイの頭をなでる'んですよね。カメラアングルや演出上で仕方がないとはいえ、その後またすぐに'左手ぶらぶら状態'に戻るのでちょっと違和感がありますが、それは突っ込まないようにしましょう。)

>全く動かないのが証拠

確かに、シェーンは右手で手綱をとり左腕をぶらぶらさせたまま去っていきます。馬上でほとんど動きませんが、その身体の揺れ方は弱々しく、確かに死を感じさせますね。
日本での論争では、この際にシェーンは墓地の中を通っていきますので「明らかに死を暗示している」という説が有力でした。「あの墓場でシェーンは死のうとしているのだ」という説もありましたが、それは穿ちすぎの解釈だと思いますね。そんな身近なところで死んだら、それを知ったあの家族がみんな悲しむことになるのだから、シェーンとしてはいまにも死にそうであっても、できるだけ遠くに行こうとしているというふうに思いたいですね。

で、実際に死んだのか?
といいますと、監督としては「ガンマンの時代が終焉して農民の時代が来る」ことを暗示しているのだと思いますね。
ストレーカーとのやりとりの中にも
シ“お前たち(ガンマン)の時代は終わった”
ス“(お前もガンマンなのに)お前はどうなんだ?”
シ“俺は心得ている”
という意味深なやりとりがあり、シェーンが時代の変遷とともにガンマンとしての自身の引き際を強く感じているふしがあります。
(このあたり『七人の侍』の“勝ったのは百姓たちだ、俺たちではない”というセリフにもつながるものがありますね。)

というわけで、シェーンは滅び行くガンマンの時代の象徴として去っていったのであり、その描写として強く'死'のイメージが描かれていますが、彼個人が死んだのか、それとも負傷したまま遠くへ去っていったのかは観客の思いにゆだねられているのでしょうね。

PS:私個人としてはシェーンは「ただ、去っていったのだ」と思いたいのであります。

昔から論争のあったネタですね。日本の映画ファンの間でだけかと思っていましたのですが、『交渉人』でも同じやりとりがあったので、“アメリカでも同じ論争があるのだな~”と思いました。

>そもそも弾に当ったという記憶がないのですが。

ウィルソン(殺し屋)もストレーカー(敵の親玉)も、まともにシェーンに向けて発砲はできていませんが、3番目の男が2階のバルコニーからショットガンで撃ったときには弾が当たった可能性があるように見えます。というか、よく見ますとアラン・ラッドは「撃たれた!」...続きを読む

Q固定した組織のウエスタンブロット

動物に起炎物質を投与してそこで発現する蛋白の免疫染色を行っています。しかし凍結切片を作製して染色してもうまく染めることができません。起炎物質の失活か、投与ミスか、あるいは抗体が古いためにラベルが外れたのか、発色工程に問題があるのか原因が不明です。
そこで、固定ずみの凍結切片(4%PFA、OCTで包埋済み)をブロックから切り出してウエスタンで目的のものを確認できないかと考えていますが、一度固定した組織片をミクロトームで薄切し、その薄切片をSDS/DTT存在下でsonicationあるいはboilなどで可溶化し、目的蛋白の発現を確認することは可能でしょうか?固定しているので、もはや可溶化することはできないでしょうか?
Vehicle投与群と起炎物質投与群の間で差があれば、再度免疫染色を再検討しようと思うのですが。ご経験のある方のご意見がいただければ幸いです。

Aベストアンサー

おそらく組織も全く違うと思いますし、私の場合はTCA固定したものですが試みたことがあります。

やるだけ無駄でした。

sonicationではなくホモジナイズでしたが、黙視できるほど可溶化してませんでした。また、ウエスタンの結果のわけわかりませんでした。

>起炎物質の失活か、投与ミスか、あるいは抗体が古いためにラベルが外れたのか、発色工程に問題があるのか原因が不明です。

このような状況では、さらにどつぼにハマる気がします。
私だったら、ウエスタンでやるなら再度サンプルを用意して固定などせず
そのままサンプルにすると思います。
急がば回れかと。


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