現在卒論で遺伝子クローニングをやっているのですが、サザンハイブリ、コロニーハイブリがうまくいきません。ファルマシアのAlkPhosDIRECTを使ってやっているのですが、どうしてもノンスペ(ネガティブを含む全てのバンド)が出てしまいます。説明書の条件はハイブリ55℃、洗い55℃でしたが、ハイブリ60℃、洗い65℃まで条件を厳しくしてやりましたがどうしても駄目です。プローブは目的の遺伝子の部分配列の500bpをクローニング後、インサートを切り出し精製して標識しています。所属の都合によりRIは使うことができません。なにかよい打開策があれば教えてください。

A 回答 (1件)

文面から判断して、対策は簡単ですね。

プローブですね。インサート切り出しの際に、ベクターのマルチクローニングサイトの配列が入っているか、ベクターそのものが混在していると考えられます。なので、それを含まないようにプローブ用のDNAを作り直す必要がありますね。

キットの通りにやっていれば問題はありませんよ。きっと。キットの保存状態や使用期限が切れていれば話は別ですが。

インサートを切り出す時に、ホンの少しのベクター配列が入っていても問題はありません。positive と negative のシグナルの強さが違うので区別できます。
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この回答へのお礼

yutaka007さんのおっしゃるとおりのプローブでやりましたが駄目でした。
現在ハイブリを使わずPCRでやることにしました。
いろいろ考えるヒントを下さってありがとうございました。参考になりました。

お礼日時:2001/11/16 03:28

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次に補足についてある程度述べさせていただきます。

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「インスリンの遺伝子クローニング法を述べよ」についてはインスリン遺伝子を全部コードしたクローンを作れ、ということでしょうから、配列を作る手前まででいいような気もします。配列の解析法まで入ってもまあ大丈夫でしょう。ですから回答の方向性は間違っていないと思います。
クローンというのは同一遺伝子の集合体のことです。つまりPCRでインスリン遺伝子をいきなり増やしても、それはインスリン遺伝子の“PCRクローン”となるわけです。今回はクローニングの方法で述べていますが、その辺を意識しておけばこの問題については的外れなことにはならないかと思います。

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本屋の専門書コーナーはご覧になりましたか??
大学生向けの入門書であれば、いずれも分かりやすいと思いますよ。
「遺伝子学」と「入門」をキーワードに探してみてください。

サイトについては、申し訳ないのですが特に知りません。。


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