よくTrisEDTA(TE)BufferがDEPC処理出来ないといいますが,
何故,TEにDEPCを処理させるといけないのでしょうか?
また,そのほかでもオートクレーブ処理が可能でも,DEPC処理が出来ない
日常的に使う試薬が幾つか存在するみたいなのですが,ご存じなら教えてください。

A 回答 (1件)

DEPCはアミノ基、イミダゾール基をエトキシホルミル化するので、アミノ基をもつTrisが大過剰にあると、そちらに作用して分解されてしまう為、結果としてRNaseに作用しなくなってしまいます。



DEPC処理できないもの(というか処理してもRNase阻害に意味のないもの)は溶液中にアミノ基、イミダゾール基を持つものが大量に入っているものということになります。

化学式をながめると、反応の機構がわかりますよ。
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この回答へのお礼

大変的確なお答えありがとうございます。
勉強になりました。

お礼日時:2001/10/23 23:27

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QTE Buffer

基本的な質問ですが、TE Bufferを作ろうとEDTA 2Na 2H2Oを買ったつもりが、EDTAを買ってしまいました。EDTAで作れますか?

Aベストアンサー

作れると思います。

試薬としてもっとも一般的なEDTAは2Na塩で、特に断りがなければこれのことですね。他に3Na塩、4Na塩、ご質問のfree-acidもあります(よくわからないですが、2Na塩より高価でこのような用途にはもったいないのでは)。

一般的にEDTAは0.5 M (pH 8.0)のストック溶液にしておいて、いろいろな試薬を作るときにはEDTA粉末を加えるのではなく、ストック溶液を使います。
EDTAは電離しにくい酸で、粉末を直接溶かそうとするとpHが下がり、低pHでは溶けにくいです。そのため、NaOHを加えながら溶かし最終的にpH 8.0に調整します。
2Na塩でも0.5 M (pH 8.0)のストック溶液を1 L作ろうとしたら、固形換算で20 g以上のNaOHが必要ですが、free-acidならさらに多く加えなければならないはずです。いうまでもないですが、free-acidは、2Na塩とはモル質量が異なりますので、2Na塩使用を前提としたレシピとは異なります。必要量は分子量から計算してください。

QTE buffer

TE bufferはTris-HClとEDTAから成り、使用目的によりpHと濃度を使い分けると言われていますが、今回DNA Competitorの作製にあたり、フィルター付きカップでの精製をする際TE Bufferを加えるとされているのですが、この場合のTE bufferの組成はどのようにしたらいいのでしょうか。
濃度や量、pH等をできるだけ詳しく教えてください。

Aベストアンサー

一般的には
10mMTris-HCl、1mMEDTA(pH8.0)ですね。
(私が使っていたのもこれだし、これ以外の組成は使ったことない)
ただ組成やpHが若干違うもの例えばpH8.5とかいう記述のものも見たことがあります。
TEはDNAを溶かして保存するときの溶液とかTE飽和フェノールを作るときなどに使いますが
多少の違いであればそれほど影響を及ぼすようには思えません。
そのフィルターの説明書などで特に指定されていなければ
一般的に使われる10mMTris-HCl、1mMEDTA(pH8.0)のもので全く問題ないと思います。

QTE bufferのpH。

TE buffer(10mM Tris-HCl + 1mM EDTA, pH8.0)のpHが8.0の理由って何なんですか?
初歩的な質問ですが、よろしくお願いします。

Aベストアンサー

補足します。

DNAは、酸性側では、徐々にですが、加水分解してしまいます。これを防ぐために、弱アルカリにしてあります。
pH7.5や8.5にすることもあります。

ちなみに、EDTAは、マグネシウムイオンをキレートすることで、DNaseの働きを抑えるために加えられています。

QDEPC処理水とRNase free水 違いは?

細胞を培養してRNA FISHを行うのですが、
そこでプロトコールに
「DEPC処理水で作った0.01M KClを・・・・」と書いてあります。

手元には『DNase RNase free水』はあるのですが、この水で0.01M KClを作ると後々影響が出てしまうのでしょうか?

Kclは培養細胞を低張処理する時に用います。その後固定します。

Aベストアンサー

DEPC処理水とDNase RNase free水は同じと考えて
良いと思います。

昔はDEPC処理してRNaseを失活させていましたが、
今はフィルターで取り除くことができます。

QDEPC処理水

DEPC水は超純水から作ると本には書いてあるのですが、蒸留水から作っているものがありました。それでも大丈夫なのでしょうか。
使用は主にRT-PCRのためで大量に消費するわけではありません。
数リットル作って、室温に置き、半年ほど使い続けているようなのですが、それはどうなのでしょう。例えば「100cc程度作って、冷蔵庫に保存して、1ヶ月程度で作り直す」など、通常どのように管理しているのか具体的に教えてください。

Aベストアンサー

こんにちは。
 超純水から作るのが普通だと思います。保存に関してはいろいろありますが、数回使用して数ヶ月たつ頃にはRNAse freeではなくなっている、とする実験書もありますので、小分けに分注しておくなどするのが通常だと思います。
 使用量がそんなに多くないのであれば、最近ではRNAse free waterもそんなに高くない値段で買えますので、小瓶に入ったモノを購入するのもてっとりばやくて便利です。


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