アポトーシスを検出する方法のひとつに細胞からDNAを抽出してRNAse,PtoteinaseK処理後、アガロースゲル電気泳動により、ラダー(はしご状)になったDNAを検出する方法があります。私は実験でHL-60という細胞にアクチノマイシンというアポトーシス誘導剤を添加してラダーになったDNAを検出しようと試みているのですが、何度試してもバンドがスメアーになってしまいます。最新アポトーシス実験法(羊土社)を参考にしていますが、原因がわかりません。是非、アドバイスをお願いします。

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A 回答 (2件)

私も直接その実験を行ったわけではないですが・・・。



 文献検査くすれば,HL-60 細胞にアクチノマイシンでアポトーシスを起こさせた時の電気泳動の図を報告している文献が見付かる筈です。それと比べてみて下さい。

 ところで,DNA ラダーとは言いますが,マーカーの様なバンドが適当な間隔で並んで見えるのはかなり分子量の小さい部分(泳動の先端部分)だけだったと思います。殆どの部分はスメアー状の帯の中にバンドと考えられる濃淡が並んだような状態になったかと。この濃淡の差があまりないとバンドも見えず,スメアーが見えるだけになります。

 もし,アポトーシスを起こしていない場合,スメアーは見られず,高分子量部分(原点付近)にバンドが見られるだけの筈です。

 つまり,お書きのスメアーはアポトーシスの結果の様に思えます。が,実物を見ない事にはハッキリした事は言えません。経験者の方に見ていただくのが確かだと思います。
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その操作をやったことがありませんが誰も書いていないようなので。



参考にされている本がこちらの図書室に見当たりませんし、
理論上は出来るのではとしか言いようがありませんが、

細胞株を変えたり試薬を変えたり(スタウロスポリンなど)しても出来ないのでしょうか。

参考URLの写真ではHL60でアポトーシスを誘導しなくてもラダーが見えていますが、
それは検出できているのでしょうか。

ゲルの出来の問題ではないことは低分子DNAマーカーで確認できているのでしょうか。
アガロースのグレードが低くて低分子の分離が悪いのならばアクリルアミドゲルに換えてみてはいかがでしょうか。

細胞をのせすぎてラダーがくっついてしまっているということも無いことは確認できているのでしょうか。
(参考URLの写真だとアポトーシスしている細胞の割合が高いとモノとジヌクレオチド以外はくっついていますね)



またはアポトーシスが検出できればいいのならば
コメットアッセイに変えたり
caspaseのWBや活性で見たりしてもアポトーシスの検出は出来ますのでそちらに変えてみてはいかがでしょうか。

参考URL:http://www.wako-chem.co.jp/siyaku/journal/biowin …
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以上のことを図入れでわかりやすく以下のURLでは解説してあります。

◎福岡大学 生化学教室 核酸の化学 転写
http://www.sc.fukuoka-u.ac.jp/~bc1/Biochem/Transcrp.htm

こんなに丁寧で,nyanzowさんに叱られるかな。今回限りです。

参考URL:http://www.sc.fukuoka-u.ac.jp/~bc1/Biochem/Transcrp.htm

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