アポトーシスを検出する方法のひとつに細胞からDNAを抽出してRNAse,PtoteinaseK処理後、アガロースゲル電気泳動により、ラダー(はしご状)になったDNAを検出する方法があります。私は実験でHL-60という細胞にアクチノマイシンというアポトーシス誘導剤を添加してラダーになったDNAを検出しようと試みているのですが、何度試してもバンドがスメアーになってしまいます。最新アポトーシス実験法(羊土社)を参考にしていますが、原因がわかりません。是非、アドバイスをお願いします。

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A 回答 (2件)

私も直接その実験を行ったわけではないですが・・・。



 文献検査くすれば,HL-60 細胞にアクチノマイシンでアポトーシスを起こさせた時の電気泳動の図を報告している文献が見付かる筈です。それと比べてみて下さい。

 ところで,DNA ラダーとは言いますが,マーカーの様なバンドが適当な間隔で並んで見えるのはかなり分子量の小さい部分(泳動の先端部分)だけだったと思います。殆どの部分はスメアー状の帯の中にバンドと考えられる濃淡が並んだような状態になったかと。この濃淡の差があまりないとバンドも見えず,スメアーが見えるだけになります。

 もし,アポトーシスを起こしていない場合,スメアーは見られず,高分子量部分(原点付近)にバンドが見られるだけの筈です。

 つまり,お書きのスメアーはアポトーシスの結果の様に思えます。が,実物を見ない事にはハッキリした事は言えません。経験者の方に見ていただくのが確かだと思います。
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その操作をやったことがありませんが誰も書いていないようなので。



参考にされている本がこちらの図書室に見当たりませんし、
理論上は出来るのではとしか言いようがありませんが、

細胞株を変えたり試薬を変えたり(スタウロスポリンなど)しても出来ないのでしょうか。

参考URLの写真ではHL60でアポトーシスを誘導しなくてもラダーが見えていますが、
それは検出できているのでしょうか。

ゲルの出来の問題ではないことは低分子DNAマーカーで確認できているのでしょうか。
アガロースのグレードが低くて低分子の分離が悪いのならばアクリルアミドゲルに換えてみてはいかがでしょうか。

細胞をのせすぎてラダーがくっついてしまっているということも無いことは確認できているのでしょうか。
(参考URLの写真だとアポトーシスしている細胞の割合が高いとモノとジヌクレオチド以外はくっついていますね)



またはアポトーシスが検出できればいいのならば
コメットアッセイに変えたり
caspaseのWBや活性で見たりしてもアポトーシスの検出は出来ますのでそちらに変えてみてはいかがでしょうか。

参考URL:http://www.wako-chem.co.jp/siyaku/journal/biowin …
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オートファジーとマクロファージって言葉の、
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Aベストアンサー

ファジーは
1 境界が不明確であること。あいまいであること。柔軟性があること。また、そのさま。「―な考え方」
2 人間の認識のあいまいな部分をコンピューターで処理する技術

ファージ は細菌に感染するウイルスの総称。正式にはバクテリオファージと呼ばれる。


オートファジー (Autophagy) は、細胞が持っている、細胞内のタンパク質を分解するための仕組みの一つ。自食(じしょく)とも呼ばれる。
https://ja.wikipedia.org/wiki/%E3%82%AA%E3%83%BC%E3%83%88%E3%83%95%E3%82%A1%E3%82%B8%E3%83%BC

マクロファージ(Macrophage, MΦ)は白血球の1種。生体内をアメーバ様運動する遊走性[1]の食細胞で、死んだ細胞やその破片、体内に生じた変性物質や侵入した細菌などの異物を捕食して消化し、清掃屋の役割を果たす。
https://ja.wikipedia.org/wiki/%E3%83%9E%E3%82%AF%E3%83%AD%E3%83%95%E3%82%A1%E3%83%BC%E3%82%B8

ファジーは
1 境界が不明確であること。あいまいであること。柔軟性があること。また、そのさま。「―な考え方」
2 人間の認識のあいまいな部分をコンピューターで処理する技術

ファージ は細菌に感染するウイルスの総称。正式にはバクテリオファージと呼ばれる。


オートファジー (Autophagy) は、細胞が持っている、細胞内のタンパク質を分解するための仕組みの一つ。自食(じしょく)とも呼ばれる。
https://ja.wikipedia.org/wiki/%E3%82%AA%E3%83%BC%E3%83%88%E3%83%95%E3%82%A1%E3%82%B8%E3%83%BC

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Q歯肉繊維芽細胞を使った実験について(アポトーシス)

歯肉繊維芽細胞にアポトーシスを起こすin vitro実験系を作ろうとしています。論文等ではPorphyromonas gingivalisの菌体タンパク質やLPSでアポトーシスを誘発するものが報告されていますが、大腸菌由来のLPSでアポトーシスは誘発できるのでしょうか?何か情報をお持ちの方は教えてください。おねがいします。

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私のところでは何故か1ページ目までしか開けませんでしたが、
http://www.blackwell-synergy.com/doi/abs/10.1034/j.1600-0765.2002.t01-1-90770.x
にP.gingivalisとE.coliのLPSを比較したデータがあるようです。

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両者の割合は一概には言えないのではないかと思います。栄養状態のみにコントロールされるのではなく、生物種のみならず、同一個体でも臓器の種類、細胞の種類にもよります。

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一方、ユビキチンプリテアソーム系は選択的なたんぱく質分解の主役となります。不必要なたんぱく質分子をひとつひとつ見つけて印をつけて壊していきます。ユビキチン自体ストレス応答たんぱく質ですし、少なからずたんぱく質代謝に貢献しているものと思われますが、分解方法はあくまでも狙い撃ちです。

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今度、泳動・染色を行ったとき泳動方向にゲルを切断し、側面から観察してみてください。

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こんばんは

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そして、ウイルス感染による細胞死はネクローシスです。

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回りくどくなってしまいましたが・・・
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という点がポイントでしょうか。
質問に添えていなければ、申し訳ありません;

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PCRで増幅後、確認のためプラスミド精製、エタノール沈殿をしてから、TEに溶解後のサンプルを10μl泳動しました。
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先染めで薄かったら、そのまま後染めをして見ましょう。
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通常、UV照射装置は感度が最高の短波長と、DNAへのダメージが少なく切り出しに適した長波長の切り替えがついています。長波長に切り替わっているとバンドの蛍光強度は低くなります。そうなっていないでしょうか。

>この発光の濃淡はDNA濃度とも関係してくるのでしょうか?わかりにくい質問ですみません。よろしくお願いします。

EtBrの染色強度でDNAの定量をするくらいですから、DNA量(重量)と蛍光強度には正の相関があります。いつも使っているマーカーも薄いとなると別の原因でしょうけれど。

Q抗癌剤とアポトーシス

多くの抗癌剤の癌細胞を殺す形態がアポトーシスによる・・・という事が本に書いてあるのですが,細胞死にはネクローシスもあるので,抗癌剤の中でアポトーシスではなくてネクローシスを誘導することによって効果を示すものがあるのかどうかを,知っている方教えて下さい.癌細胞を殺すにはアポトーシスの方が都合がいいのでしょうか.

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わずかな例外を除き、あまりないと思います。例外的なものは実際の治療には使われないと思います。

http://www.sam.hi-ho.ne.jp/tootake/mikeisai2.htm

> ネクローシスは栄養不足、毒物、外傷などの外的環境要因による受動的細胞死で、アポトーシスは個体の増殖制御機構でプログラムされた能動的細胞死です。

 癌細胞は、正常細胞のアポトーシス制御機構に異常が生じることによって異常増殖を起こしたものと考えられています。

 アポトーシスは、ネクローシスよりも短期間に完結し、しかも炎症を伴わない細胞死です。したがって、アポトーシス誘導物質は、より有効な抗癌剤として期待されています。

 アドリアマイシンやビンブラスチンに代表される多くの抗癌剤の作用機構は、アポトーシス誘導によるものであることが明らかにされています。

http://www.t3.rim.or.jp/~envmedri/15eiyogk.htmは具体的物質名が書いてないので怪しい。

Qアガロースゲル電気泳動の失敗

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私の経験ではウェルに穴が開いていて,全部漏れ出ていた…なんてこともあります.切り分け作業のときにゲルがよじれてウェル下に亀裂が入っちゃったのかもしれませんよ.

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今、研究テーマの選定中でアポトーシスを選ぼうと思います。ただ、悪性腫瘍である扁平上皮癌になぜアポトーシスが起こるのでしょうか?悪性腫瘍は発育が早いし起こらないほうが発育が早いと思うのですが・・・。あとアポトーシスは発育速度と関係がるのでしょうか?、またアポトーシスにはいろんなカスケードがあるようなのですが扁平上皮癌に多いようなアポトーシス誘導の機構はあるのでしょうか?知っているかたどうかよろしくお願いします。

Aベストアンサー

アポトーシスは不要になったり、変異を起こした細胞などを除去するために細胞分裂を制御する遺伝子や、細胞の化学組成的変化などによっておこる現象なので、当然癌細胞にも起こります。
がん細胞の永久分裂能力や衰えない並外れた分裂速度に比べて癌組織全体の増殖は緩慢です。これから、多くの癌細胞が細胞死を起こしていることがわかります。しかし、組織の中心の細胞は栄養や酸素の不足でネクローシスをおこすことがあり、アポトーシスのみが細胞死の原因とは断定できません。
アポトーシスはp53遺伝子やc-myc遺伝子産物やこれらの相互作用によって起こるといわれています。c-mycについてはMaxタンパク質との複合体を形成することや、逆に発現に低下によってアポトーシスが起こるともいわれています。この遺伝子はbcl-2という遺伝子により抑制され細胞は癌化されるといわれています。
このような過程を経てプロテアーゼやエンドヌクレアーゼが誘導されます。プロテアーゼによりさいぼうの凝縮、断片化、エンドヌクレアーゼとの相互作用によってDNAの断片化と核の凝縮がおこります。
又、アデニレートシクラーゼによりATPから合成されるcAMPによるPKAの活性化やPI代謝回転の産物による小胞体からのカルシュウムイオンの放出によって上記の二種の酵素が活性化されます。
外的な要因としてはT細胞によるレセプター(TCR)を介した腫瘍壊誘引サイトカインであるTNFの細胞内放出の誘導などがあげられます。
このようなアポトーシスの経路は一般的なカスケードであり、扁平上皮癌特有のものではありませんし、固有の経路が発見されるほど研究は進んでないと思います。細胞の内的、外的条件によって経路は様々なのでいまだ明らかにされてない部分が多く、十分説明できないところや、ここに書ききれない部分も多くありますが参考にしてみて下さい。 

アポトーシスは不要になったり、変異を起こした細胞などを除去するために細胞分裂を制御する遺伝子や、細胞の化学組成的変化などによっておこる現象なので、当然癌細胞にも起こります。
がん細胞の永久分裂能力や衰えない並外れた分裂速度に比べて癌組織全体の増殖は緩慢です。これから、多くの癌細胞が細胞死を起こしていることがわかります。しかし、組織の中心の細胞は栄養や酸素の不足でネクローシスをおこすことがあり、アポトーシスのみが細胞死の原因とは断定できません。
アポトーシスはp53遺伝子やc-...続きを読む

QDNA抽出実験でDNAが消えた・・・

実験でブロッコリーと鳥のレバーからそれぞれのDNAの抽出を行いました。
方法は以下のとおりです。

両試料を冷凍させてから(ブロッコリーは穂先のみを)すりおろし、たんぱく質を切り離すため界面活性剤を加えて、乳鉢・乳棒を使ってよくすりつぶす。
2M食塩水を40ml加え5分ほど湯銭にかけ、ガーゼで濾過する。
ろ液を良く冷やして、冷エタノール20mlを静かに入れる。

ここでまだ不純物を含んだDNAが繊維状になって出てくる。--------★

巻き取ったものを別のビーカーに入れ、2M食塩水40mlを加えてよく溶かす。
再び湯煎する(3分間)。
厚いうちに濾過をする。
ろ液を良く冷やしてから、冷エタノール20mlを静かに入れ、ガラス棒で静かにかき混ぜる。
すると純度の高いDNAがでてくる。

といった実験だったのですが、鳥レバーに関してはうまくいったのですが、ブロッコリーのDNAが★の時点ではかなり多く出てきていたのに最終的に影も形も出てきませんでした。

最初の試料の量が少なかったのかと思い、試料量を二倍にして同じようにしてみたのですが、やはり★の時点では出てくるのに最終地点では消えてしまいました。
どんな理由が考えられるのでしょうか?
教えてください!

なお最初の試料量は穂先だけで20gを用いました。
最終の時点での溶液は浮遊物もなく無色透明でした。
冷エタノールはあらかじめ冷蔵庫で冷やしていたものを用い、加える量を増やしても変化はありませんでした。

実験でブロッコリーと鳥のレバーからそれぞれのDNAの抽出を行いました。
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両試料を冷凍させてから(ブロッコリーは穂先のみを)すりおろし、たんぱく質を切り離すため界面活性剤を加えて、乳鉢・乳棒を使ってよくすりつぶす。
2M食塩水を40ml加え5分ほど湯銭にかけ、ガーゼで濾過する。
ろ液を良く冷やして、冷エタノール20mlを静かに入れる。

ここでまだ不純物を含んだDNAが繊維状になって出てくる。--------★

巻き取ったものを別のビーカーに入れ、2M食塩水40mlを加...続きを読む

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DNA分解酵素(DNase)によって分解してしまったのでは。DNaseは材料となる生物試料の中にはもちろん、環境中(手垢、汗、つば、器具や試薬の汚れ、ホコリなど)に普通にあるものです。研究の現場では、器具や試薬は蒸気釜で滅菌したものを使い、試料中のDNaseがすばやく不活性化するように試薬や手順が工夫されています。

今回はそこまで厳密な実験ではないようですから、DNaseの影響はかなりあったでしょう。レバーからうまくいったのは、たまたま試料中のDNase活性が低かったからではないでしょうか。

湯煎は何度でやりましたか。おそらくここでしっかり熱を加えておけばDNaseはほぼ完全に失活し、うまくいったのではないでしょうか。研究室でやる方法では、タンパク質が変性し、DNAが変性しない温度、65度から70度くらいで、最低でも10分から15分は加熱します。液量が40 mlもあると失活温度に達するのに時間がかかり、酵素反応に適した温度がかなり続いたと思います。すばやく失活温度にするように工夫したほうがいいですね。


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