QC-PCR(Quantitative Competitive-PCR)についてその原理が良くわかりません。
PCRプライマーを競合させるようなのですが、具体的にどのように働いて競合させ、
そしてどのように定量するのでしょうか?

どうか丁寧に教えてください。おねがいします。

このQ&Aに関連する最新のQ&A

A 回答 (2件)

ふつう、PCRというのは検出するDNA断片の一つに対して、


一対のプライマーを設計しますよね。
ところがこの場合には増幅がプラトー(増幅限界を超えて、それ以上増えない状態)になった場合に、
定量が正確にできなくなってしまいます。ですから普通は、キャリブレーションを
とって、最適な増幅回数を決定してから本実験(定量実験)を行うわけです。
この場合はプライマーの余剰が問題になるわけです。
(と、この辺の話はおわかりでしょうか?)

一方、競合的PCRの場合は、目的とするDNA断片に加えて、”それと異なる配列を
持つけれども、同じプライマーで増える別のDNA断片(RT-PCRの場合は
内部標準となるDNA断片を加えることが多い)”を加えます。
もちろん、この別に加えるDNA断片はあらかじめ量が分かってるものです。
そうすると、2種類のDNA断片が、1種類のプライマーを奪い合う訳ですから、
増幅がプラトーに達してしまう前にプライマーが枯渇してPCRが終了します。
(この「奪い合う」状態が、「競合的」の語源になってます)
後から加えたDNA断片は、量が分かっているわけですから、それに対して
目的のDNA断片の増幅量を比較すれば、定量ができるという仕組みです。

競合的PCRは定量的PCRを行う方法のなかでも、
プライマーの余剰によるプラトー効果を防ぐ方法というわけです。

たぶん、これであってたはずです。家に帰ればちゃんとした資料が
置いてあるのですが…。現在会社なので(笑)
学生時代のつたない記憶を思い起こして回答してます。

#1の方の話は、
バイオ実験イラストレイテッド3+:細胞工学別冊
「新版 本当に増えるPCR」第8章
中山広樹著、(株)秀潤社発行 のことですよ。
競合的PCRの話は図がないとひじょーに説明しにくいので(笑)
いちど本屋さんをのぞいてみることをおすすめします。
ただし、医学部がある大学内の本屋か、紀伊国屋や旭屋、進々堂など、
専門書を扱っているかなり大きな書店でないと、置いてないですよ!
    • good
    • 0

「細胞工学別冊 バイオ実験イラストレイテッドの3+」中山…とか分かり易く書いてなかったっけ???うる覚えなのでこれぐらいで勘弁してください。

    • good
    • 0

このQ&Aに関連する人気のQ&A

お探しのQ&Aが見つからない時は、教えて!gooで質問しましょう!

このQ&Aを見た人が検索しているワード

このQ&Aと関連する良く見られている質問

Q疑問詞:view of what V + S

基礎的な疑問だと思うのですが、どなたか教えてください。

views of what is legitimate authority.

という句に出会ったのですが、どうして、これは、

views of what legitimate authority is.

とならないのでしょうか?

翻訳本のこの部分は「正統な権威に関する了解」となっています、よって、この部分は間接疑問文だと思われので、

view of what S + V

ではないかと考えたのですが、、、。

疑問詞は苦手で、、、どなたか、お教えください。

Aベストアンサー

こんにちは。4/24のご質問ではご丁寧なお返事を有難うございました。

<翻訳本のこの部分は「正統な権威に関する了解」となっています、よって、この部分は間接疑問文だと思われので、
view of what S + V
ではないかと考えたのですが、、、。>

翻訳はわかり易い意訳にするので、原作者がどういう意図でwhatを使ったのかは、原作者しかわかりません。Whatを主語と見るか、補語とみるかこの英文からは推測できません。

というのは、what is legitimate authorityの語順になっているからといって、whatが主語とは断言できないからです。実はこの語順でも、whatが補語の場合もありうるのです。それは、主語が長くて頭でっかちになる文章では、しばしが主語と動詞の倒置が行われるからです。

つまり、この文は

1.what is legitimate authority:
whatが主語S、isが不完全自動詞V、legitimate authorityが補語Cで、「何が正当な権威か(という見解)」という意味

2.what legitimate authority is:
legitimate authorityが主語S、isが不完全自動詞V、whatが補語Cで、「正当な権威は何か(という見解)」だが、主語が長すぎるので、便宜上what is legitimate authorityの語順にしたもの。あくまで主語はwhatではなく、legitimate authorityである

という2つの見方が可能なのです。

翻訳では、「What(何)」の働きがわからないように、どちらの訳にも当てはまるよう、あいまいな名詞「正当な権威」と訳しています。これは、whatの働きが何なのか、翻訳者でもわからないという事情によります。つまり、whatの働きは原作者でなければわからないのです。「正当な権威」という訳は、どちらの意味にもとれる、あいまいな訳になっているのです。

以上ご参考までに。

こんにちは。4/24のご質問ではご丁寧なお返事を有難うございました。

<翻訳本のこの部分は「正統な権威に関する了解」となっています、よって、この部分は間接疑問文だと思われので、
view of what S + V
ではないかと考えたのですが、、、。>

翻訳はわかり易い意訳にするので、原作者がどういう意図でwhatを使ったのかは、原作者しかわかりません。Whatを主語と見るか、補語とみるかこの英文からは推測できません。

というのは、what is legitimate authorityの語順になっているからといって、what...続きを読む

QCompetitive (RT-) PCRについて

Competitive(RT-)PCRの原理は何とか理解したのですが、実際に定量実験をするときに、Competitorに具体的に何を使用して良いか分かりません。Competitorは市販されていて購入できるものなのでしょうか?
それとも自分で検討して、DNAなどを精製又は合成して加えるものなのでしょうか?
合成オリゴなどを使用するのでしたら Competitorの選択基準など教えてください。またPrimerなどもTargetに特異的なもの以外で使用するのでしたら是非教えてください。
今現在、細胞由来のmRNAの定量をしたいと考えているのですがノーザン法では余りうまくいきません。是非よろしくお願いします _(,~,)_

Aベストアンサー

 昔少し行っていたので(昔なので間違って言っていたり、方法が変わっていたらごめんなさい)書きますが、RT-PCRってreverse transcription- polymerase chain reactionですよね。
 ほんでもって、Competitive(RT-)PCRは、対処となる標準mRNAを入れて
Competitiveに増殖させて、本当に目的のもが、頭打ちになった状態の増殖にならない様に行うと思ったのですが。違います??
 以下のHPでは合成したものを使用しています。自分のときは少し記憶があいまいでしたけど、増える事が分かって、濃度が測定されているRNAとプライマーを入れた記憶があります。同じ系でPCR行って、増えているかを見たと思います。
 RT-PCRも色々な方法がありますので、そちらも試されてはいかがですか?

参考URL:http://sockeye.sci.hokudai.ac.jp/Teaching/rtpcr.html

QメルセデスベンツSクラスのモデルチェンジ

少し前まで自動車雑誌等で,今年はにメルセデスベンツSクラスのモデルチェンジがある予定との記載が多くありました.しかし昨年の暮れあたりからはモデルチェンジの予想からSクラスの名前を見なくなりました.このあたりの事情をご存じの方がいらしたらごぜひ教示ください.

Aベストアンサー

昨年晩秋に次期SLがスクープされてしまい、そちらを販売するための準備&開発などを優先しSクラスは後回しに…だそうです。

Qプライマー(PCR・RT-PCR用)の保存

 約一ヶ月前にプライマーを注文しました。発注から一週間ぐらいで届いたのですが、そんなに急いでいなかったので、届いた後は開封もせず、そのまま恒温室(22℃、湿度約60%:人の出入りがあった場合は多少前後すると思います。)に保存しておきました。近々そのプライマーを使ってPCRをやる予定でいるので本日(12/9/'04)封を開けてみたら、なんと「乾燥品」だと思っていたのが「溶液」でした!送られてきた時は常温出荷だったのですが、注意書きにも当然-20℃で保存と明記されています。果たしてこのプライマーはまだ使えるのでしょうか?どなたか教えてください。よろしくお願いします。m(_ _)m

Aベストアンサー

使用できるか使用できないかといわれれば使用できます。
が、能力を発揮できないため、同一製品を次回購入して使用した場合に再現性が確保できないかと思います。

したがって、使用しない方がいいかと思います。

Qホンダ フィット1.5S MT 購入検討中です モデルチェンジの時期はいつ?

ホンダのフィット1.5S MTを購入検討中です。
このクルマの次回モデルチェンジの時期はいつ頃ですか?

また、競合する車(他社メーカ同等クラスで検討する車)をおしえてください。
MT車を希望してます。

Aベストアンサー

フィットのマイナーチェンジが12月にあるようです。

Qイノシン入りの縮重プライマーに適したPCR酵素は?

”はじめまして。D2の学生ですが、今年度より分子生物学関係の実験を始めました(これまでは生態学的なテーマが殆どでした)。うちの研究室自体が分子生物学をやり始めたばかりなので、初歩的な質問が多いかと思いますが、お答え頂ければ幸いです。また、誤った用語などありましたらご指摘ください”

【質問】
アミノ酸配列のみが分かっている遺伝子を釣ってくるために、縮重プライマーの設計を試みています。その際、Takaraのカタログを参考にしますと、イノシンが入っているprimerでPCRを行う際には、Ex Taqのような補正機能がついたTaq polymeraseを使うと増幅能が落ちるので、出来れば避けることと書いてありました。実際に使われている方々は、イノシン入りのdegenerate primerを用いる際にはどのような酵素を用いているのでしょうか。アドバイス下さい。ちなみに、増幅配列は500bp前後です。

Aベストアンサー

こういうのはやってみなければわからないところがあって、教科書の理屈どおりにやってもうまく行くとは限らないし、少々逸脱していてもうまく行く時はうまく行くものだと思っています。私なら、こういうことも考えてみますという点をヒントとして、

・最初から目的配列の全長を狙うとプライマー配列の選択肢が限られてしまうので、ごく一部、100 bpでも30bpでもいいからうまくプライマーが設計できるところで増幅します。そこからその遺伝子の正確な配列が得られたら、inverse PCRやligation mediated PCR(LM-PCR)など、確実性の高いプライマーで周辺配列を増幅するのは容易です。

・25 ntのプライマーを作るとして、全長が満足いく設計ができなくても、3'末端の10 ntなり15 ntなりが妥当であれば、5'側の配列が絞りきれなくて、適当なコドンをえらんでしまってもうまくいくかもしれません。3'側のマッチである程度PCR産物ができれば、それが鋳型になる時は末端配列が設計したプライマーの配列に置き換わっているので、PCRがかかりやすくなります(PCRでmutationを導入したり、末端に制限酵素サイトやタグ配列をいれるのと同じ理屈)。

・nested PCRを考えます。degenerationの制限から、十分に長く特異性の高いプライマーは設計できないかもしれません。目的の断片だけが特異的に増幅しなくても、そのPCR産物を鋳型にして、少し内側に設計したプライマーでnested PCRをかけます。この時、プライマーの3'末端の配列を確実性の高そうなコドン配列にして、末端はプライマー配列に置き換わっているので、一回目のプライマー配列とオーバーラップする部分はその配列に準じて設計すればいいです。

こういうのはやってみなければわからないところがあって、教科書の理屈どおりにやってもうまく行くとは限らないし、少々逸脱していてもうまく行く時はうまく行くものだと思っています。私なら、こういうことも考えてみますという点をヒントとして、

・最初から目的配列の全長を狙うとプライマー配列の選択肢が限られてしまうので、ごく一部、100 bpでも30bpでもいいからうまくプライマーが設計できるところで増幅します。そこからその遺伝子の正確な配列が得られたら、inverse PCRやligation mediated PCR(LM-...続きを読む

QウォークマンSシリーズ

iPodtouchからウォークマンにしようかと思って、調べたところSシリーズに決めました。Fシリーズにはハイレゾがありますが、Androidが入っていて、バッテリーが短いことからボツにしました。しかし、ハイレゾは高音質なのでハイレゾ対応の機種が良いです。
そこで質問なのですが、Sシリーズの次のモデルチェンジでハイレゾ対応になることはあり得ますか。
また、モデルチェンジが発表されるのはいつ頃ですか。

Aベストアンサー

>モデルチェンジが発表されるのはいつ頃ですか。

Sシリーズに限って言えば9月末頃です
ハイレゾは個人的に思うには、あり得ないと思います
消えたAシリーズでもフルデジタルアンプS-Master搭載ぐらい
尚、Sシリーズは過去からS-Master搭載していないです
http://www.sony.jp/technology/sound/smaster/

F880シリーズの場合
MP3などの圧縮音源をハイレゾ相当の高解像度音源にアップグレードする「DSEE HX」により、ハイレゾ音源でなくてもCD以上の高音質を楽しめます。
「DSEE HX」のF880はアップグレードにて可能で前機種のF800はダメです
アップデート開始日2013年12月11日
[1] DSEE HX機能を追加
http://www.sony.jp/walkman/update/2013.html

QPCR プライマー等の入れ方

PCRを行う時に、Mgやプライマー、buffer等を少量ずつ入れますが、それぞれ入れる度にピペッティングしていますか??
それとも壁面につけて遠心して落としていますか?
どちらでも良いとは思いますが、どちらがベターかと疑問に思いました。
みなさんはどちらでやっていますか??

Aベストアンサー

 No.5のJagar39です。
 1つ書き忘れていたのですが、チップに液が残ることによるロス、は「腕」が上がればほぼゼロになります。
 チップにも液切れが良いチップとそうでもないチップがあって、液切れが良いチップを使うと非常に楽です。液切れはクオリティのイエローチップが抜群に良いのですが(-200uLのチップ)、そうでもないチップを使っても、まあほとんどチップ内に液が残ることはないです。

 細かい「職人芸」の話をしますと、マスター作製の際やテンプレートを入れる時など、チューブ壁面にチップを触れさせるとそこに液が残るので、機械にかける前に軽く遠心しなければならなくなります。手で振る程度でもけっこう落ちてくれますが。
 なので私は壁面には触れず、チップ先端を直接液内に入れています。
 そのまま第二ストッパーまで押し込むとエアが入りますし、そのチップを引き上げると毛細管現象でチップ内に液が入ってしまうので、第二ストップまで押し込む動作と同時にチップの引き上げを始め、最後の液がチップから放出されるのとチップ先端が液面から出るのが同時、くらいのタイミングでやると、完璧に入れることができます。

 96穴プレートで同じことをやるのはとても難しく、最初は切実にプレート遠心機が欲しい!と思ったのですが、500検体ほどやったら馴れてしまいました。
 今では96穴プレートをフルに使っても、壁面にはまったく液は残りませんしエアもまったく入りません。そのまま即機械にかけることができています。

 外部から研究費をもらっている課題は、あくまで通常業務プラスアルファなので、時間をそれほど割けるわけではありません。なのでどうしても検体をひたすら溜め込んで一気にPCRを、というスケジュールになりがちで、1日に200検体を3回転で、とかいう無茶なやれ方になるのですが、手早くやらないと3回転なんてできないし、さりとて雑になるとまともなデータが出ないし、ということで、「必要があれば技術は向上する」ということですね。
 診断の仕事でも、遺伝子引っかけてしまったら即テレビのニュースになるような検体を100とかやる羽目になると、コンタミでもさせようものなら首をくくらねばなりませんから・・・
 迅速かつ高精度に、ということです。

 No.5のJagar39です。
 1つ書き忘れていたのですが、チップに液が残ることによるロス、は「腕」が上がればほぼゼロになります。
 チップにも液切れが良いチップとそうでもないチップがあって、液切れが良いチップを使うと非常に楽です。液切れはクオリティのイエローチップが抜群に良いのですが(-200uLのチップ)、そうでもないチップを使っても、まあほとんどチップ内に液が残ることはないです。

 細かい「職人芸」の話をしますと、マスター作製の際やテンプレートを入れる時など、チューブ壁面にチップ...続きを読む

Q新型ウォークマンSシリーズの発売時期はいつですか?

現行モデルがモデルチェンジのときに破格になるのを期待しているのですが
新型モデルの発売日の検討がつきません。


予想でいいのでお願いします




ただ現行モデルは iPod nano の不調もあり今まで以上の人気なのでモデルチェンジのときには売り切れかもしれませんが……

Aベストアンサー

9月初旬に発表があると思います(発売時期等)

Q競合阻害と非競合阻害

なぜ、競合阻害では最大速度は不変で、非競合阻害ではKmが不変になるのですか?競合阻害剤は酵素の基質との結合を妨害するが、触媒作用を妨害しないからで、非競合阻害剤は酵素と基質との親和性を変えないからと言われてもよくわかりませんでした。どうかよろしくお願いします。

Aベストアンサー

まず、最大速度は、基質濃度が無限大のときの反応速度です。つまり、そこにある酵素がすべてESになった時の反応速度です。ですから、基質と活性部位を競合する阻害剤が有限濃度なら、無限に濃い基質とは競合できません。したがって、競合阻害剤では、最大速度は変わらないのです。
つぎに、非競合阻害剤は結合しても、基質と酵素の結合には影響しません。だからEI複合体にさらにSが結合して、ESIができます。つまり、酵素の基質に対する結合しやすさ、言い換えれば親和性は、阻害剤の影響を受けないのです。しかしESIからは反応生成物ができませんから、反応最大速度、つまりそこにある酵素が最大限作用して実現できる反応速度は、全部がESにはなれず、一部はESIとなって反応から外れていますから、阻害剤がないときよりも小さくなります。
なおEI,ESIがともにできるが、つまり非競合阻害剤と同じように作用するが、EとESとではIの結合に対する親和性が違う場合は、混合型の阻害になります。


人気Q&Aランキング

おすすめ情報