QC-PCR(Quantitative Competitive-PCR)についてその原理が良くわかりません。
PCRプライマーを競合させるようなのですが、具体的にどのように働いて競合させ、
そしてどのように定量するのでしょうか?

どうか丁寧に教えてください。おねがいします。

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A 回答 (2件)

ふつう、PCRというのは検出するDNA断片の一つに対して、


一対のプライマーを設計しますよね。
ところがこの場合には増幅がプラトー(増幅限界を超えて、それ以上増えない状態)になった場合に、
定量が正確にできなくなってしまいます。ですから普通は、キャリブレーションを
とって、最適な増幅回数を決定してから本実験(定量実験)を行うわけです。
この場合はプライマーの余剰が問題になるわけです。
(と、この辺の話はおわかりでしょうか?)

一方、競合的PCRの場合は、目的とするDNA断片に加えて、”それと異なる配列を
持つけれども、同じプライマーで増える別のDNA断片(RT-PCRの場合は
内部標準となるDNA断片を加えることが多い)”を加えます。
もちろん、この別に加えるDNA断片はあらかじめ量が分かってるものです。
そうすると、2種類のDNA断片が、1種類のプライマーを奪い合う訳ですから、
増幅がプラトーに達してしまう前にプライマーが枯渇してPCRが終了します。
(この「奪い合う」状態が、「競合的」の語源になってます)
後から加えたDNA断片は、量が分かっているわけですから、それに対して
目的のDNA断片の増幅量を比較すれば、定量ができるという仕組みです。

競合的PCRは定量的PCRを行う方法のなかでも、
プライマーの余剰によるプラトー効果を防ぐ方法というわけです。

たぶん、これであってたはずです。家に帰ればちゃんとした資料が
置いてあるのですが…。現在会社なので(笑)
学生時代のつたない記憶を思い起こして回答してます。

#1の方の話は、
バイオ実験イラストレイテッド3+:細胞工学別冊
「新版 本当に増えるPCR」第8章
中山広樹著、(株)秀潤社発行 のことですよ。
競合的PCRの話は図がないとひじょーに説明しにくいので(笑)
いちど本屋さんをのぞいてみることをおすすめします。
ただし、医学部がある大学内の本屋か、紀伊国屋や旭屋、進々堂など、
専門書を扱っているかなり大きな書店でないと、置いてないですよ!
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「細胞工学別冊 バイオ実験イラストレイテッドの3+」中山…とか分かり易く書いてなかったっけ???うる覚えなのでこれぐらいで勘弁してください。

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Aベストアンサー

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パラメータは
A. コロニーの数(プレーティングするを振っていたなら、数十から数百コロニーまいたプレートを採用します。少なすぎるとサンプリングによる振れが大きくなりますし、数えるのが不正確になります。同じ量をまいたプレートが複数ある場合は平均します)。

B. Aを与えたプレーティング細胞の体積
C. プレーティング細胞全体の体積(回復培養のため加えたSOC培地の体積でよろしい)
D. 使用したプラスミドベクターの重量(ライゲーション産物の場合はベクターの重量のみで、インサートは勘定にいれない)

計算例)
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1 ng x 100 uL/1000 uL=0.1 ng

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形質転換効率の意味を理解していれば、単純な割り算、掛け算です。特に公式のようなものはありません。
パラメータは
A. コロニーの数(プレーティングするを振っていたなら、数十から数百コロニーまいたプレートを採用します。少なすぎるとサンプリングによる振れが大きくなりますし、数えるのが不正確になります。同じ量をまいたプレートが複数ある場合は平均します)。

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簡単に教えていただけませんか。

Aベストアンサー

1.大腸菌のサスペンションにアルカリ溶液を入れる
(大腸菌の膜が壊れて、タンパクやDNAなどが出てくる。DNAはアルカリで変性して一本鎖になる)

2.酸で中和する
(変性したタンパクなどは析出、長いゲノムDNAは中和で二本鎖に戻ろうするが、長いので絡まって析出。プラスミドDNAは小さいので二本鎖に戻って溶液中に存在)

3.遠心分離して上澄みを回収
(タンパクや絡まったゲノムDNAなどは沈殿、上澄みにあるプラスミドDNAを回収)

4.昔は(10年前の記憶だと)、フェノール・クロロホルムで、残りのタンパク質・脂質などを除く。
(脂質はフェノール層へ、DNA・RNAは水層へ、タンパク質は中間層へ分離するので、水層を回収)

5.その後、イソプロパノールでDNA・RNAを沈殿させる。(イソプロパノールでDNAの水和水が取られて、DNAが不溶化して沈殿する)

6・RNA分解酵素でRNAを分解して、もう一度フェノール抽出をして、エタ沈(イソプロと同じ原理)して、その沈殿を回収するとプラスミドDNAが得られる。

キアゲンは、4のところで、カラムにかけると、DNAが樹脂に結合するので、bufferで不要なものを洗い流して、最後にpHを変えると、プラスミドDNAは溶出されてきます。キアゲンのホームページからマニュアルをダウンロードすれば、詳しく書いてありますよ。

1.大腸菌のサスペンションにアルカリ溶液を入れる
(大腸菌の膜が壊れて、タンパクやDNAなどが出てくる。DNAはアルカリで変性して一本鎖になる)

2.酸で中和する
(変性したタンパクなどは析出、長いゲノムDNAは中和で二本鎖に戻ろうするが、長いので絡まって析出。プラスミドDNAは小さいので二本鎖に戻って溶液中に存在)

3.遠心分離して上澄みを回収
(タンパクや絡まったゲノムDNAなどは沈殿、上澄みにあるプラスミドDNAを回収)

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Q抽出DNAの保存

PCRに使用するため臓器から抽出したDNAを4℃で保存中ですが、保存期間はどのくらいまでが限界でしょうか?また、-20℃では保存期間はどのくらいですか?

Aベストアンサー

精製度によると思います。
簡易な方法で粗精製したものだと数週間から数ヶ月で明らかな分解が認められることがありますが(それでもPCRには使えるかもしれませんが)、超遠心法、フェノール抽出を慎重に行う、イオン交換カラムで精製などでnucleaseのコンタミを排除しておけば、数年単位の長期間にわたり4℃で分解なく保存できます。
私は最近、3年以上前にQiagenのDNaesyで精製してそのまま4℃で保存したゲノムDNAを使いましたが、電気泳動像に分解は認められずPCRの増幅も良好でした。

長期保存する場合、注意する点は、溶媒をTEにしておくこと(純水だとpHが酸性に偏るなどが原因で分解が起きやすくなる)、DNA濃度をあまり低くしないことです(たとえば数十ng/uL以上にする、水分子によるアタックを抑えるため)。

-20℃、-80℃などで凍結保存すれば、粗精製のDNAでも半永久的に保存できます。ただし凍結融解で物理的にせん断されてくるので、バックアップとして長期保存する場合はともかく、日常使うサンプルとしては避けたほうがいいでしょう。凍結を防ぐためにエタノールを加えてフリーザーに保存し、使うときになったらエタノール沈殿で回収するというのもいいでしょう。乾燥沈殿で保存するのは、確かに安定ですがゲノムDNAの場合再溶解が困難になるのでやめたほうがいいですね。

精製度によると思います。
簡易な方法で粗精製したものだと数週間から数ヶ月で明らかな分解が認められることがありますが(それでもPCRには使えるかもしれませんが)、超遠心法、フェノール抽出を慎重に行う、イオン交換カラムで精製などでnucleaseのコンタミを排除しておけば、数年単位の長期間にわたり4℃で分解なく保存できます。
私は最近、3年以上前にQiagenのDNaesyで精製してそのまま4℃で保存したゲノムDNAを使いましたが、電気泳動像に分解は認められずPCRの増幅も良好でした。

長期保存する場合、注...続きを読む

QKcat/Km Kcatについて

Kcat/Km と  Kcatの意味をおしえてください。

よろしくおねがいします

Aベストアンサー

ごく簡単に言うと、他の過去問、↓の様な感じです。
http://detail.chiebukuro.yahoo.co.jp/qa/question_detail/q115032236
より厳密には、↓の(e)反応特異性のあたりを見て下さい。
http://square.umin.ac.jp/aoki530t/prorogu_daigaku/cyoubunshi3.htm


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