アルカリ-SDS法で大腸菌のプラスミドを抽出しているのですが、最近、リゾチームで処理した後にsolution(2)(0.2N NaOH-1%SDS)を添加しても液が透明になりません。ですが、粘性は出ます。これって溶菌できているんでしょうか?今、リゾチームは4mg/mlの濃度で回収した菌体に100μl添加しています。

A 回答 (1件)

透明になっていないので、おそらくは溶菌が不完全だと考えられます。



プラスミド抽出のスケールはどのようにしていますか?オーバーナイトカルチャーを 1.5ml tube に取って、100,200,150 μl ですか?これぐらいが普通だと思いますが、万が一大腸菌を遠心繰り返しなどして、大量のペレットをこのスケールで処理しようとしていたら、ムリだと思います。

soln1,2,3 のボリュームを上げれば解決します。200,400,300 でためしてみてはどうですか?

あとは万が一の可能性ですが、soln2 が長期保存のせいでへったっていたり、あるいはつくり間違い(?)の可能性もあります。最近寒いので、 SDS が析出してはいないか、などもチェックですかね。
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この回答へのお礼

 solution3以外はつい最近作ったので、大丈夫だと思います。方法はsa ke no miさんのおっしゃる方法と同じです。とりあえず、solutionのボリュームを上げてみようと思います。ありがとうございます。

お礼日時:2001/12/04 16:07

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Aベストアンサー

昔ながらの手法で、キットは使わずに精製されているのですね。昔はできていたのに、最近とれなくなったということから、いくつかの可能性が考えられます。

1)培地の抗生物質
抗生物質の活性は落ちていませんか?活性が落ちていると,培養中にプラスミドが抜け落ちてしまいます。本培養を止める1~2時間前に、抗生物質を培地に追加し、培養を続けることで、プラスミドが落ちるのを避けることができます。

2)SolIの温度
SolIは常時4度保存、使用時に氷冷していますか?中に酵素(RNase)が入っています。酵素が弱っている可能性はないですか?撹拌も、培養液の4度を保ったまま行ってください。

3)SolIでの撹拌
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思いつくのは以上です。たっぷりととれるといいですね。
がんばってくださいね。

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1)培地の抗生物質
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