出産前後の痔にはご注意!

シャーレに細胞を培養するとき、接着率をよくするため?コラーゲンコートしたいと思うのですが、
あまりにも初歩的なのか、詳しく方法を紹介している資料がなかなか見つけられません。
ぜひ教えて下さい。
お願いいたします。

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A 回答 (2件)

私の研究室で行っている方法を紹介します。



collagen 1mg
0.02N 酢酸 10mL

の溶液を作製する。溶けにくいのでボルテックス後しばらく振とうさせる。
これをクリーンベンチで濾過滅菌してディッシュに入れ、ベンチ内に1時間静置します。UVはコラーゲンを破壊するので当てないようにしています。
参考になればと思います。
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この回答へのお礼

ありがとうございました。
参考にさせていただきます。

お礼日時:2005/12/02 11:49

適量に水で薄めたコラーゲンを適量、ディッシュに入れて数時間シェーカーで振る。


PBSで洗う。

こんだけ。
コート用に買ったコラーゲンなら適用量も書いてあるでしょう。
自分的には濃度はぶっちゃけあまり気にしなくていいと思います。振ってる間に適当に底面にコラーゲンがくっつくだけですから。
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この回答へのお礼

ありがとうございました。
参考にさせていただきます。

お礼日時:2005/12/02 11:48

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Qエクセル STDEVとSTDEVPの違い

エクセルの統計関数で標準偏差を求める時、STDEVとSTDEVPがあります。両者の違いが良くわかりません。
宜しかったら、恐縮ですが、以下の具体例で、『噛み砕いて』教えて下さい。
(例)
セルA1~A13に1~13の数字を入力、平均値=7、STDEVでは3.89444、STDEVPでは3.741657となります。
また、平均値7と各数字の差を取り、それを2乗し、総和を取る(182)、これをデータの個数13で割る(14)、この平方根を取ると3.741657となります。
では、STDEVとSTDEVPの違いは何なのでしょうか?統計のことは疎く、お手数ですが、サルにもわかるようご教授頂きたく、お願い致します。

Aベストアンサー

データが母集団そのものからとったか、標本データかで違います。また母集団そのものだったとしても(例えばクラス全員というような)、その背景にさらならる母集団(例えば学年全体)を想定して比較するような時もありますので、その場合は標本となります。
で標本データの時はSTDEVを使って、母集団の時はSTDEVPをつかうことになります。
公式の違いは分母がn-1(STDEV)かn(STDEVP)かの違いしかありません。まぁ感覚的に理解するなら、分母がn-1になるということはそれだけ結果が大きくなるわけで、つまりそれだけのりしろを多くもって推測に当たるというようなことになります。
AとBの違いがあるかないかという推測をする時、通常は標本同士の検証になるわけですので、偏差を余裕をもってわざとちょっと大きめに見るということで、それだけ確証の度合いを上げるというわけです。

QDMEM培地について。

DMEM培地に含まれる

・グルコース
・L-グルタミン
・フェノールレッド
・HEPES

それぞれの効果というか意味を教えてください。

よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

L-グルタミンについては、
http://www.summitpharma.co.jp/japanese/service/s_ATCC_faq_cell_biology.html#q8
「培地にL-glutaminの添加は必要ですか?どの程度のL-glutaminを添加したらよいですか?なぜ information sheetにL-glutaminの記載がないのですか?」
を見て頂けると良いと思います。
最終的にはどの培地にも添加されます。

参考URL:http://www.summitpharma.co.jp/japanese/service/s_ATCC_faq_cell_biology.html#q8

QHepG2の継代について 凝集しないようにするには?

卒業研究の実験で、ヒト肝ガン由来細胞株HepG2を扱うことになり、最近培養のトレーニングを始めました。
しかし、継代する際にトリプシンで剥がすと、どうしても凝集してしまい、新しいdishに播いても凝集した細胞が目立ちます。今自分がやっている操作は下の通りです。

100mm dishに1×10の5乗 cells/ml で播き込み、
培養4日目に培地を捨ててPBSで洗浄し、
トリプシン液1mlを加えて3~5分間インキュベートし(このとき1分毎に顕微鏡で観察しています)、
培地を加えて剥がし、ピペッティングして細胞数を計測、
遠心して培地を捨て、新しい培地で希釈して、dishに播いています。
ちなみに培地は低グルコース濃度のDME培地(serum +)です。

実験では、培地に食品成分を添加し、細胞の脂質合成へ与える影響を調べるのですが、凝集したままの細胞を使用すると細胞が十分に食品成分を取り込めないのではないのか、という不安があります。
そのため、細胞をばらばらにするためにしっかりピペッティングしたりしていますが、時間がかかるために培地の色が赤紫に近くなってしまい、細胞に対するダメージがかなり心配です。

細胞が凝集しないように継代する方法はありますか?

それとも、私が凝集させてしまうのは、単に技術的な問題でしょうか?慣れてくればバラバラにできるようになるのでしょうか?

どなたか、経験のある方、教えてください!

卒業研究の実験で、ヒト肝ガン由来細胞株HepG2を扱うことになり、最近培養のトレーニングを始めました。
しかし、継代する際にトリプシンで剥がすと、どうしても凝集してしまい、新しいdishに播いても凝集した細胞が目立ちます。今自分がやっている操作は下の通りです。

100mm dishに1×10の5乗 cells/ml で播き込み、
培養4日目に培地を捨ててPBSで洗浄し、
トリプシン液1mlを加えて3~5分間インキュベートし(このとき1分毎に顕微鏡で観察しています)、
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Aベストアンサー

結論から言って技術不足です。継代の仕方事態にそれほど問題はなさそうですが、トリプシン処理中の操作とハーベストの時に問題がありそうです。

トリプシン処理中に1分ごとに観察しているとありますが、その時の操作は慎重にトリプシン液を大きく揺らさないようにしていますか?液が揺れると特にディッシュの周りから細胞がシート状にはがれて凝集しやすくなります。

細胞をハーベストする時は勢いよく一気にメディウムをかけます。フラスコではなくディッシュなのでメディウムが飛び出さない程度に強さ加減してください。ピペッティングも細胞にダメージを与えるので極力少なくしいます。私の場合はハーベスト時のピペッテティングは3回以内です。

ちなみに完全にバラバラにするのは細胞にとってあまりよくありません3~5個の塊が均一にあるのがベストです。


培養細胞をやれる環境にあるということは当然先輩たちもやっているはずですね。まずは先輩たちに聞いて、自分がやっている様子をみてもらってアドバイスをもらうことです。ここで、文章で読んでできるなら、既にできているはずですから。HepG2は凝集しやすいですが練習で改善できるでしょう。ディッシュを増やして毎日、数枚継代できる状態を作りましょう。


頑張ってください。

結論から言って技術不足です。継代の仕方事態にそれほど問題はなさそうですが、トリプシン処理中の操作とハーベストの時に問題がありそうです。

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Q細胞培養中の継代でのトリプシン処理について、改善方法を教えてください。

現在、接着系ヒト癌細胞を使っております。

継代の際に、容器中培養液の1/5量のトリプシン/EDTAを添加して、3分インキュベートしてから、同量の培養液を入れて、ピペッティングして細胞を剥がしております。
しかし、なかなかプレートから細胞が剥がれず、インキュベート時間を長くしたり、セルスクレーパーを用いたりして無理やり剥がしてみたのですが、細胞塊が増えるだけで、細胞がバラバラになってくれません。

遠心をして、トリプシン溶液を除いて培養液中でピペッティングしても細胞塊状態で、細胞がバラバラになってくれません。

現在、他に教えていただく方がおりませんので、ご教授よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

こんにちは。
PBSにCaははいってはいませんか?

細胞が古い状態だとトリプシン処理をしてもはがれにくくなることがあります。
継代数はどうですか?
継代数が進んでいるようであればストックをおこしてみるのも手です。

それと、トリプシンを使わずにPBS(-)を加えて4℃で15分から30分おいてピペッティングではがすという方法があるようです。
(私はやったことはありませんが、以下の掲示板でみかけました)

参考URLですが日本組織培養学会の細胞培養に関する質問掲示板です。
過去スレを検索するとなにかみつかるかも・・

参考URL:http://jtca.dokkyomed.ac.jp/JTCA/QA/index-SS.html

QW/V%とは?

オキシドールの成分に 過酸化水素(H2O2)2.5~3.5W/V%含有と記載されています。W/V%の意味が分かりません。W%なら重量パーセント、V%なら体積パーセントだと思いますがW/V%はどのような割合を示すのでしょうか。どなたか教えていただけないでしょうか。よろしくお願いいたします。

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w/v%とは、weight/volume%のことで、2.5~3.5w/v%とは、100ml中に2.5~3.5gの過酸化水素が含有されているということです。
つまり、全溶液100ml中に何gの薬液が溶けているか?
ということです。
w/v%のwはg(グラム)でvは100mlです。

Qプロモーター領域

ある既知のタンパク質遺伝子のプロモーター領域の配列を知りたいというときにはどのように検索すればよろしいのでしょうか。
タンパク質そのものの配列までは調べられたのですが…その後がよくわからなくて。

Aベストアンサー

実験的に同定するのは結構手間です。
まず、転写開始点を正確に決めておく必要があります。
簡便には、5' RACEの産物の端がどこにきてるかで見てもいいと思いますが、完全に伸びきっていない逆転写産物もPCRで増やしてしまうので、多少のあいまいさがでてきます。
正確に決めるには昔ながらのprimer extensionやS1 mappingが必要でしょう。
で、プロモーターは(発現をmodulateするエンハンサーは話が別です)、典型的には転写開始点の-50 bp以内にあります。たとえば、真核生物では、-20 bp 前後にTATA boxまたはGC box、さらに-15 bp くらい上流に-CAATboxとか。そういう典型的な配列があれば、8割がたそこがプロモーターだという蓋然性を言うことができます(かならずしも典型的なプロモーターばかりではありませんが)。
ちゃんと実験的に証明しようとしたら、候補となる領域にレポーター遺伝子をつないで、in vitroやin vivoで転写活性を調べなければならないでしょう。システマティックに欠失シリーズや、点突然変異を作って、どの配列がプロモーター活性に必要十分であるかを明らかにすれば完璧です。

実験的に同定するのは結構手間です。
まず、転写開始点を正確に決めておく必要があります。
簡便には、5' RACEの産物の端がどこにきてるかで見てもいいと思いますが、完全に伸びきっていない逆転写産物もPCRで増やしてしまうので、多少のあいまいさがでてきます。
正確に決めるには昔ながらのprimer extensionやS1 mappingが必要でしょう。
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Q細胞の増殖曲線、doubling timeについて

今後、培養細胞を用いた実験を行う予定があるのですが、使用する予定の細胞の正確なdoubling timeが分りません。どなたか詳しい増殖曲線とdoubling timeの測定法、またはそれが分るようなホームページ等をご存知の方、教えて下さい。ちなみに、使用予定の細胞はHepG2(ヒト肝癌由来)とEA hy926(ヒト上皮細胞由来)です。よろしくお願いします。

Aベストアンサー

細胞のダブリングタイムというのは種々の条件でまったく違ったものになります。
FBSはもちろんのこと、ディッシュのコーティング、播く密度や細胞の継代数でも違います。特に癌細胞由来以外のものでは継代数が多くなってしまっているものは増えないことがたまにあります。
また、中には継代している間に変異してしまって元のものとは違ったものになってしまったものもあります。

ですので、ダブリングタイムはおおよそのことしか言えません。そのため、どんな実験でも特定条件下でのコントロールというのが重要になってくるわけです。

増殖曲線の書き方は…まぁ、五日ぐらいでコンフレントになる濃度で1週間ぐらい毎日、細胞を回収して数えるだけです。(別に三日ぐらいでコンフレントになる濃度で五日ぐらい数えてもいいとは思いますけど。)

Qブロッキングって必要なのでしょうか?

蛍光染色法で2次抗体の非特異性を抑えるために、2次抗体と同種の動物の血清でブロッキングしなさいとよく書いてあるのですが、例えば2次抗体がヒトの血清タンパクで吸収済みのものを使用するときに、ヒトのタンパク質を調べる上ではブロッキングしなくてもよいように思うのですが、どうなのでしょうか?
やはりバックグラウンドは高くなってしまうのでしょうか?

Aベストアンサー

抗体を吸収処理するのと、ブロッキングは狙っているところがちょっと違います。

たとえば抗マウスIgGの二次抗体を、ラビット血清タンパク質で吸収してあれば、ラビット由来の一次抗体に交差反応するのを防ぐことができます。一次抗体でマウス由来のものとラビット由来のものをつかって、別々の抗原を検出できるようになります。


組織標本にせよウェスタンブロットにせよ、抗体に限らず、いかなるタンパク質でも多かれ少なかれ吸着します。あらかじめ適当なタンパク質を吸着させることによって、抗体が非特異的に吸着されるのを押さえるのがブロッキングです(この点に関しては、BSA、カゼイン、ヘパリン、各種血清、どれでも狙いは一緒です)。

特に組織標本の場合、タンパク質のなかでも特に抗体が非特異的に吸着しやすい性質があるかもしれません(たとえば、プロテインA/Gとか補体のようなタンパク質が存在するかもしれません)。また、それぞれの種の抗体が、内在的にもっている交差反応性があるかもしれません。そのためには血清、とくに後者の理由から、同種の血清でブロッキングするのがよいとされています。

ただ、私の経験では、どうしても「同種の」血清でなければよくないというようなことはありませんでした。
また、非特異的吸着や交差反応は、抗体ごと、サンプルの種類ごとに違うので、ブロッキングの必要性もまちまちです。ものによっては、全くブロッキングなしでもきれいに染まるものもあります。

抗体を吸収処理するのと、ブロッキングは狙っているところがちょっと違います。

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QkDaからbpへの変換について

例えば206kDaの分子量をbpで表すには、どのような計算方法を取ったらいいのでしょうか??それとも、計算できないのでしょうか?皆さん、解答を宜しくお願いします。

Aベストアンサー

kDaはタンパク質の分子量でしょうか

http://clontech.takara-bio.co.jp/product/catalog/010001005.shtml

で概算できます。

アミノ酸によって分子量は変わるので、
kDaから正確なアミノ酸数は計算できないため、
正確なbpは計算できません。

Qベクターとプラスミドと形質転換

ベクターとプラスミドって何が違うんですか?
意味的にはほとんど同じだと思うんですが。

形質転換で大腸菌に入れて増やしますが形質転換の時に導入した物と同じものが得られるんですよね?

形質転換によってプラスミドはどれくらい増えるものなのですか?

Aベストアンサー

こんばんは。
もう答えは出ておりますので、補足を少しします。

プラスミドベクターはハイコピーの物とローコピーの物があります。
一つの細胞内(ここでは大腸菌一体の事をさします)。で増えるプラスミドの量はベクター内の複製起点及びそ周辺のDNAシークエンスによって異なります。

pUC、pBR系などの有名なハイコピーベクタープラスミドの複製起点はColE1をアレンジした配列が含まれており、一細胞内で500程度のコピー数になります。

それに反してpACYC系に見られるローコピーベクタープラスミドはp15の様な複製起点が厳密に定義されている物はコピー数が少ないです。
これによって一細胞内でのコピー数は20-30程度です。
この様に考えますとベクターコピー数も収量に大きく関与するファクターと言えます。

No.1さんは恐らくハイコピープラスミドベクターのオーバナイトカルチャーの事をご指摘されているのだと思います。

下らない補足、失礼致しました。


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