マウスのゲノムDNAをMbo(1)やEcoR(1)で切断処理した後に、フェノ/クロ処理をしても全く精製されません。制限酵素処理を行なったマウスゲノムを使う時はProteinaseK処理も加えて行わなければならないのでしょうか?実験が全く進みません。経験のある方や、こうじゃないかと思われる方がおりましたら是非教えてください。お願いします。

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A 回答 (2件)

こんにちは。


なるほど、よくわかりました。
精製度を上げる方法として私が思いつくのは、
・2度、3度のフェノクロ→エタ沈
・DNA精製用のキット、あるいはカラム等を使用する
ということくらいです。
1.6というのは確かのちょっと汚い感じですね。一度、フェノクロ前の比とフェノクロ後の比で比べてみてはいかがでしょうか?つまり、本当にタンパクが除去されているのか、ということをチェックされてはいかがでしょうか。
 「その時点で変性云々」は、「精製されない」というのがもしかしたらDNAをロスしている、と言う意味の質問だったのかなと、最初思ったからです。失礼しました。
 あと、あえて気になったことがあるとすれば、抽出された時点でのDNAはきちんと精度が出ているのか、という点です。組織によっては夾雑物が取れにくいものもあるかと思うのですが、でもこれも普通は確認されてますよね?
 私が思いついたのはこのくらいです。お役に立ちますでしょうか?
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この回答へのお礼

詳しい説明ありがとうございました。
参考にして、早速検討してみたいと思います。
本当にありがとうございました。

お礼日時:2001/12/19 19:00

こんにちは。


 「精製されません」の意味は、DNAが無くなってしまう、とうことですか?それとも、タンパクが除去されない、ということですか?
 制限酵素で切断する前には、当然DNAはある(存在する)わけですよね?DNAの抽出法は何を使っていますか?夾雑物によってその時点で変性していることはありませんか?

フェノクロのポイントは、
・フェノールがきちんとTEで平衡化されていること。古いものはpHがかわっている場合がありますので、1ヶ月以内くらいに作ったものがいいでしょう。
・フェノクロ液と、DNA溶液をきちんとエマルジョンになるまで混合すること。
くらいだと思います。そして、普通は吸光光度計で精製具合をチェックしますが、もしまだゴミが多いようならもう一度フェノクロをすることもあります。普通は制限酵素処理でしたら一回で十分でしょう。

補足を頂ければ、またアドバイスいたします。

この回答への補足

御回答、ありがとうございました。
補足させて頂きます。
「精製されない」と申しますのは、タンパクが除去されないという事です。
フェノクロ処理したDNAをエタチンし、TEに溶かしたものを一部希釈し吸光度を測定しております。
260/280での吸光度の比が1.6程度で、かなり精製されていないと考えています。
フェノール、クロロホルムは市販されているものでまだ新しい状態のものを使用しています。そしてnyanzowさんの回答にある「フェノクロのポイント」にある事はもちろん行った上で精製されないという事です。
フェノクロ処理している時のDNA濃度は100μg/ml程度になっていると思います。


「制限酵素で切断する前には、当然DNAはある(存在する)わけですよね?DNAの抽出法は何を使っていますか?夾雑物によってその時点で変性していることはありませんか?」
nyanzowさんが御回答なさいました上記の文ですが、「その時点で変性している」の箇所の解釈ができませんでした。申し訳ありませんがやさしく書いてもらえると有難い所存です。すみません。
DNAの抽出法ですが、Proteinase Kを用い、フェノクロ処理、次にRNase処理、フェノクロ処理を行ないました。

文才もなく、汚い文で申し訳ありません。
更なるアドバイスを頂けるとうれしく思います。

補足日時:2001/12/19 12:14
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(2)反応速度を上げるために、37℃で一時間のところを47℃で30分で行う。

どなたか教えて下さい。お願いします。

Aベストアンサー

>しかし、それなら37℃では失活してしまうようにも思います
そのとおり、徐々に失活します。ですから、インキュベーションは、1‐2時間、長くても一晩ですむように酵素量を調整するのです。各制限酵素がインキュベーションの条件で、何時間後にどれだけ活性を保持するかというような情報は、試薬会社のカタログにも出ています。

>制限酵素を加える時は温度を上げないように注意するのはなぜでしょうか
スター活性を防ぐためです。酵素は凍結防止のためグリセロール溶液で保存されて、反応液に加えても容易には拡散しません。一次的に酵素濃度と粘性が非常に高い部分ができ、非特異的な配列を切断する可能性があります。酵素を加えてよく混和するまで冷やして、反応が起こらないようにするのがよいのです。
>(2)反応速度を上げるために、37℃で一時間のところを47℃で30分で行う。
これも、スター活性の原因になり、非特異的な切断がおこる可能性があります。失活を早めることにもなります。

>(1)チューブにDNA、制限酵素等を全て加えたところで中断して、-20℃で保存する。

実際上は、いけるかもしれません。しかし、凍結してしまうと酵素は多かれ少なかれ失活するので、切断効率が起こることは覚悟しておかなければならないでしょう。

>しかし、それなら37℃では失活してしまうようにも思います
そのとおり、徐々に失活します。ですから、インキュベーションは、1‐2時間、長くても一晩ですむように酵素量を調整するのです。各制限酵素がインキュベーションの条件で、何時間後にどれだけ活性を保持するかというような情報は、試薬会社のカタログにも出ています。

>制限酵素を加える時は温度を上げないように注意するのはなぜでしょうか
スター活性を防ぐためです。酵素は凍結防止のためグリセロール溶液で保存されて、反応液に加えても容易には...続きを読む

Q遺伝子、染色体、DNA、、ゲノムの違いを分かりやすく教えてください

iPS細胞を作るのには、皮膚細胞に4つの遺伝子を入れ、初期化するそうです

遺伝子
染色体
DNA
ゲノム
4つをわかりやすく説明してください
出来れば、RNAも

Aベストアンサー

No.1です。コメントに対して。
>遺伝子全部合わせてゲノムと言う
で良いと思います。元々造語ですから・・・。
遺伝子(gene)+染色体(chromosome)から合成。
DNAの全ての遺伝情報のことを言います。


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