私は化学系の学科に所属する大学生です。
生物化学の学生実験でPCRとゲル電気泳動を行ったんですが、課題の回答がわからず困ってます・・・
どなたか教えていただけませんか?
(1)検出された電気泳動のバンドに関して、25サイクルの時のODと30サイクルでなぜ違いがかなりあるのか?
(2)全くバンドが検出されないサンプルもあるが、それはなぜか?
(3)mRNAの発現を正確に行うのになぜPCRのサイクル数が重要なのか?
(4)電気泳動で検出されたバンドに関して、bpを解析する際にサイズマーカーの位置と比較する以外にどう考察・解析したらいいのか?
4つもあってすみません!生物系はほんとに苦手なんです・・
どれか1つでもいいので教えてください!
あとできれば考察の材料なんかも教えてもらえると嬉しいです・・
No.2
- 回答日時:
1)
比較しているのがバンドなのかODなのか質問文が良くわかりませんが、
PCRの1サイクル中に何が起きているのかを調べてください
2)
増えない反応液と、増えた反応液の組成(もしくはtemplateにしているもの)を比較してください。
もしくは操作を間違えて、
何か入れ忘れたために
または余分なものを入れてしまったために
増えていないのかもしれません。
3)
サイクル数とPCR反応産物の濃度の関係はこんな感じになります。
http://bio.takara.co.jp/catalog/application.asp? …
(色の違いはおそらく増幅するmRNAの濃度です)
この中の特に
http://bio.takara.co.jp/catalog/images/3702e.gif
の図を見てください。
4)
いいアドバイスが思いつきませんが、
(市販のサイズマーカーを使っていないという意味で)
すでに何bpかわかっているポジティブコントロールと比較して上か下か同じかを調べたり、
塩基配列を読むことによって何bpか調べることもできます。
No.3ベストアンサー
- 回答日時:
(1)検出された電気泳動のバンドに関して、25サイクルの時のODと30サイクルでなぜ違いがかなりあるのか?
PCRの原理を見ると理論上2のn乗(n=サイクル数)で
PCR産物は増えていきます。
そのため25と30サイクルだと2の5乗の違いが出ます
ただ、実際やってみるとわかるのですが
鋳型量が多かったりするといち早く
PCRが限界量まで増えてしまうことがあります
それはPCRが進むことでdNTPやプライマーが
失われたり、酵素が失活するためです。
25サイクルよりも前にプラトーに達するようですと
25と30の間に差は大してなくなります。
(2)全くバンドが検出されないサンプルもあるが、それはなぜか?
一言で言うとPCRがうまくいっていない
ということですね。
プライマー設計が悪い。鋳型の状態が悪い
作業的なミス(入れ忘れなど)
Tm値などのプログラムミス
こういったところでしょうか
目的のものがあるか無いかという実験であれば無い
(3)mRNAの発現を正確に行うのになぜPCRのサイクル数が重要なのか?
mRNAの発現量を観察する場合は
ほとんどの場合、いったんcDNAに逆転写して
その後、そのRT-PCR産物を鋳型として
通常のPCRを行います。
肝心の目的物の量を測る方法はいくつかあるのですが
最も簡単なものはPCRがプラトーに達する前に
PCRを止め(20サイクル程度)電気泳動後
ゲル染色やサザンブロットによって
目的産物量を可視化、定量します。
mRNA量が多い=鋳型量が多い=同サイクル数なら
より強いシグナル
となるわけです。
もう一つの方法はリアルタイムPCRと呼ばれる方法で
検出試薬にサイバーグリーン(2本鎖のみが
検出される)を用いて1サイクル進むごとに
PCR産物量をシグナルから算出する方法です。
「ライトサイクラー」で検索すると
その機器がどういうものかわかると思います。
これを使って
「ある一定量にPCR産物が達するときのサイクル数」
を求めます。mRNA量が多い=鋳型が多い=より少ない
サイクル数で一定量に達する
(4)電気泳動で検出されたバンドに関して、bpを解析する際にサイズマーカーの位置と比較する以外にどう考察・解析したらいいのか?
目的のバンド以外があるのか無いかも重要です。
PCRの特異性は実験によっては非常に重要に
なるからです。
低分子側にもわっとしたシグナルが多いと
プライマー設計やPCR条件がゆるく、
プライマーダイマーができているとか
いうことも電気泳動像から見ることができますね
ありがとうございます。
自分が悩んでたことにほとんど答えていただいてなんとかレポートの仕上がりにもゴールが見えてきました!
後は考察をがんばるのみです。
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