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約2000bpのDNA配列に対して、20bpほどの配列が含まれているかを調べたいと思っています。
NCBIのBLAST 2 SEQUENCESを試してみましたが、パラメータの設定が良くないのか、両者の塩基数が極端に違うためか、うまくアライメントされません。
ギャップを入れてアライメントしてくれる無料のウェブツールやウェブページがあれば、お教え下さい。

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A 回答 (2件)

これなんかどうですか。



参考URL:http://www.ch.embnet.org/software/LALIGN_form.html
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この回答へのお礼

geneticist12さん、ありがとうございました。初めてみるサイトでした。さっそく使わせて頂いたのですが、とても使いやすかったです。

お礼日時:2006/03/20 02:54

clustalwは使えませんか?



参考URL:http://www.ddbj.nig.ac.jp/search/clustalw-j.html
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この回答へのお礼

お礼が遅くなり申し訳ありません。
こちらで相談させて頂く前にclustalwを使ってみたところ、うまくいかなかったのですが、再度試したらうまくいきました。コンピューターの問題だったようです。
ありがとうございました。

お礼日時:2006/03/20 03:03

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Q遺伝子の塩基配列の調べ方

ヒトのALDH2遺伝子の全塩基配列(エクソン部及びイントロン部の配置)を調べたいのですが、どうやって調べていいのかがわかりません。
検索サイトで検索かけてみたりしたのですが見つかりません。(ネット上にデータベースがあるというのを聞いたことがあります。)
調べる方法を教えてください。お願いします。

Aベストアンサー

NCBIの場合
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
seachの選択項目の中からgeneを選びALDH2を検索します

ALDH2がテキストに含まれるデーターのリストが得られると思いますので、適切な物を選択してください
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=gene&cmd=Retrieve&dopt=full_report&list_uids=217
ここから、Related Sequencesのgenomicを見つけてそのシーケンスを見てもいいのですが非常に長いテキストで、目的のもの以外の配列も入っていることもかなりありますので、右のlinksから、Map viewerに飛びます。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/maps.cgi?taxid=9606&chr=12&query=uid(14218883)&QSTR=217%5Bgene%5Fid%5D&maps=gene_set&cmd=focus

ALDH2 OMIM HGNC sv pr dl ev mm hm sts.... という文字列があると思います。dlをクリックしデーターを取得するページに飛んで Display かSave to Disk データーを得てください。

ほかのデーターベースだと
http://www.ensembl.org/index.html
のhuman
http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/index.html
の右上からALDH2検索
詳細は省略します。ひつようであればおっしゃってください。

NCBIの場合
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
seachの選択項目の中からgeneを選びALDH2を検索します

ALDH2がテキストに含まれるデーターのリストが得られると思いますので、適切な物を選択してください
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=gene&cmd=Retrieve&dopt=full_report&list_uids=217
ここから、Related Sequencesのgenomicを見つけてそのシーケンスを見てもいいのですが非常に長いテキストで、目的のもの以外の配列も入っていることもかなりありますので、右のlinksから、Map viewerに...続きを読む

Q塩基配列の同一性(%)を計算したい

いまはWinのフリーソフトBioeditを使ってシークエンスの並べ替えをしています。

いくつかの塩基配列同士の同一性(identity)の計算をしたいのですが、いくらいじってもそれらしきものが計算できません。
相同性でネットを検索するとBLASTとかそういう結果しか出なくて、同一性で検索すると双子の同一性とかしか見つけられなくて困っています。

ひとつだけBioeditでそれらしきものとしてidentity matrixという表がでて(まるで総当たり戦のような表)が出ましたが、数値が0.280とか0.180とかで、この数値の意味も分からなく使えません。

どなたか
bioeidtで同一性の算出方法をご存知の方教えてください。
または、ネットで(配列を送ったら)計算できる場所をご存知のかた教えてください。

Aベストアンサー

bioeditは使用したことがないので分かりませんが、参考リンク先でBLASTエンジンを用いてウェブ上でアラインメントを作れます。その際にIdentityも計算してくれます。

参考URL:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgi

Qエチジウムブロマイドについて

まったくの初心者なので・・・・・。
泳動後のゲルの染色についてお尋ねしたいのですが、
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誰か教えて下さい。宜しくお願いします。

Aベストアンサー

kimwipeさんとdora1さんとほぼ同様です。私は後染めですが、EtBrは10mg/mlで遮光室温でストックしており、水200mlに2mlを加えています。別に用事調整ではなく、何度か使いまわしています(捨てるのに手間がかかりますので)。5分程度シェーカーの上で置いて、その後数回水洗いです。写真を撮る場合、キムワイプ等で水気を切ってから撮っています。ただ、すぐに撮るとバックが強く出る感じがあるので、10分程度おいてから撮っています。ただし、置きすぎるとバンドがぼけます。kimwipeさんがおっしゃるとおり、ゲルにあらかじめEtBrを加えておくと、きれいにバンドが染まるし、泳動中にUVで確認できますが、EtBrが陰極か陽極側に(忘れました)寄るので、ゲルの濃度とバンドの位置によってはバンドとバックが重なるかもしれません。

Q2つのシークエンスによる結果の違い

PCR後の精製産物をシークエンスするダイレクトシークエンスとクローニングしてプラスミド回収してからのシークエンスの2パターンで配列解析をしました。

するとダイレクトシークエンスはうまく読めたのですが、もう一方のシークエンスのほうは、配列を読めずNと表示されました。

一般的にダイレクトシークエンスは、うまく配列を読むことが困難だということを聞いたことがあります。

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そこでクローニング済みのシークエンスのほうの長短所って何なのでしょうか?

回答よろしくお願いします。

Aベストアンサー

こんにちは。

実際の実験では、発現ベクターの構築や変異探しを精査するときにクローニングした産物をシーケンスします。ダイレクトシーケンスでも変異は探せますが、研究者によっては、例えばクローニングされたプラスミドを20個シーケンスして、aggaAaaaが15個、aggaTaaa(配列は適当なのでBlastとかに投げないでくださいね)が5個なので、鋳型はA型が3に対してT型が1存在するという定量をする方もいます。ダイレクトシーケンスでも不可能ではありませんが、1:1ではなく、2:1とか4:1の定量性を見るのは難しいかと思います。

ダイレクトシーケンスは、増えたPCR産物をそのまま読むために、鋳型のある塩基が----taatGc----と----taatCc----が1:1で含まれているとき(ヒトゲノムでは父方と母方の塩基が違うことがよくあります)、次のようなメリットが考えられます。
・(メリット)そのシーケンスの波形はGとCが一対一で出てくるように定量性がややあること
・(メリット)シーケンシング反応はたまにエラーを起こしますが、それはマイノリティになります。正しい配列の波形の方が大きく出るので、鋳型の配列にほぼ一致した配列が読めます。

クローニング済みのシーケンスは、1クローンだけ読むと、その配列がシーケンシング反応によるエラーの塩基置換を含む危険性が高い一方で、
・一見、単一の産物に見えても1塩基レベル、あるいは全体にわたって複数の産物がPCRで増幅されたときに、複数のクローンをシーケンスすることでなにが増えたか調べられます。ダイレクトシーケンスではこれは難しいです。
・(先の方も書かれていますが)基本的には単一のプラスミドの配列を読むため、シーケンスがきれいに読めるはずですし、その後の応用(発現用のベクターに入れる)にはプラスミドでの塩基配列の正しさの確認が必要です。

クローニングしたプラスミドを読む場合はインサートの長さにもよりますが、最低3個くらい読んだ方が良いと思います。

プラスミドのシーケンスがうまくいかなかったとのことですが、制限酵素で確認されたのことでものは入っているのだと思います。シーケンシング反応はエタ沈がちょっとマズイだけでシーケンスが読めなくなったりするので、もう一回同じ事をやると読めるようになるかもしれません。
シーケンシングプライマーですが、プラスミドにあるシーケンシングプライマーの配列(T7, SP6, M13など)が実は、シーケンシング反応に有利な配列でないことがあります。最近は合成オリゴの値段も安いので、「同じ配列を複数読む」ようなことであれば、自分の入れたインサートにある配列でシーケンスされるのがよいと思います。「中から外に読む」感じです。もし、サイズが500bpとか小さいようならPCRで増やしたときに使ったfowardとreverseプライマーで網羅できるでしょう。
あと、ご存じと思いますが、シーケンス反応に持ち込むプラスミドとPCR産物の至適な量が違うので、そこの確認をされても良いかと。

また、制限酵素処理の代わりに、拾われたプラスミドを一度50uLのLBに移して、そのうちの1uLを鋳型にコロニーPCRなどでインサートの有無を確認して、インサートの入ったものだけを増やすとたくさんのコロニーをカルチャーしなくて済みます。

がんばってくださいね!

こんにちは。

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Qプロモーター領域

ある既知のタンパク質遺伝子のプロモーター領域の配列を知りたいというときにはどのように検索すればよろしいのでしょうか。
タンパク質そのものの配列までは調べられたのですが…その後がよくわからなくて。

Aベストアンサー

実験的に同定するのは結構手間です。
まず、転写開始点を正確に決めておく必要があります。
簡便には、5' RACEの産物の端がどこにきてるかで見てもいいと思いますが、完全に伸びきっていない逆転写産物もPCRで増やしてしまうので、多少のあいまいさがでてきます。
正確に決めるには昔ながらのprimer extensionやS1 mappingが必要でしょう。
で、プロモーターは(発現をmodulateするエンハンサーは話が別です)、典型的には転写開始点の-50 bp以内にあります。たとえば、真核生物では、-20 bp 前後にTATA boxまたはGC box、さらに-15 bp くらい上流に-CAATboxとか。そういう典型的な配列があれば、8割がたそこがプロモーターだという蓋然性を言うことができます(かならずしも典型的なプロモーターばかりではありませんが)。
ちゃんと実験的に証明しようとしたら、候補となる領域にレポーター遺伝子をつないで、in vitroやin vivoで転写活性を調べなければならないでしょう。システマティックに欠失シリーズや、点突然変異を作って、どの配列がプロモーター活性に必要十分であるかを明らかにすれば完璧です。

実験的に同定するのは結構手間です。
まず、転写開始点を正確に決めておく必要があります。
簡便には、5' RACEの産物の端がどこにきてるかで見てもいいと思いますが、完全に伸びきっていない逆転写産物もPCRで増やしてしまうので、多少のあいまいさがでてきます。
正確に決めるには昔ながらのprimer extensionやS1 mappingが必要でしょう。
で、プロモーターは(発現をmodulateするエンハンサーは話が別です)、典型的には転写開始点の-50 bp以内にあります。たとえば、真核生物では、-20 bp 前後にTATA boxま...続きを読む

Q蛋白の分子量(kDa)を調べる方法

かなり低レベルな質問なのですが、、、、
分からなくて困っています
約750個のアミノ酸からなる蛋白の分子量を知りたいのですが、どうやって調べたらいいのでしょうか?
よろしくお願いします

Aベストアンサー

アミノ酸配列データがあるなら、計算してくれるソフトウェアがあります。市販の遺伝子解析ソフトウェアには必ずついている機能ですが、ウェブ上でできるサイトもあります。たとえば

http://us.expasy.org/tools/pi_tool.html

実験的に調べるなら、SDS-PAGE、ゲルカラムクロマトグラフィ、TOF-MASSなど、材料や精度に応じていろいろ方法があります。

Qプライマーダイマーが出てしまいます。

PCRがうまくいきません。プライマーダイマーが出てしまいます。
鋳型DNAが少ないとできやすいと聞いた事があるのですが、鋳型はあまり
たくさんないので、増やす事もままなりません。
他に何か良い方法があったら教えて下さい。

Taqポリメラーゼを使っています。Hot Startしてもダメでした。

例えば、プライマーを減らしたりするのは有効でしょうか??

Aベストアンサー

いちばん確実でシンプルな解決策は、プライマーを変更することだと思います。プライマーダイマーができてしまうということは、自分がデザインした2ヶのプライマーに、相補的な配列があるということです。アニールしてしまうのですから、温度や濃度などのファクターを変更しても、やはりアニールは起きてダイマーをつくりかねません。頑張っても徒労に終わる可能性があるので、相補的な部分をつくらないように、プライマー配列をデザインし直すのが早いと思います。

Q脱イオン水、MilliQ、蒸留水 の違いを教えて下さい

こんにちは。お世話になります。

バイオ、生化学系の実験に従事しているものですが「水」について教えて下さい。

水道水、脱イオン水、MilliQ、蒸留水(二段蒸留水)、超純水の違いを教えて下さい。
お互いの関係などありましたら(○○を~すると△△になる等)教えていただけると
わかりやすいかもしれません。

また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?

よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は除けません。

蒸留法は水を蒸留することで不純物を除く方法です。イオン交換法と組み合わせて2回蒸留することが一般的です。一般的な2次蒸留水の比抵抗は数MΩ・cmでバイオ・生化学関係には十分な純度です。動物培養細胞にも使用可能です。エンドトキシンも完全にフリーとまではいかないけれどもある程度の除去はできています。蒸留法は多くの不純物を除去可能ですが100度付近の沸点を持つ物質は除けません。

逆浸透法は半透膜に圧力をかけて精製する方法です。

限外濾過法は限外濾過膜を通す方法です。孔径は半透膜が数十nmに対し、限外濾過膜は数nmです。それゆえ、数kDa以上の分子であれば、限外濾過法で除けますので、エンドトキシンやRNaseなども除去できます。本当にエンドトキシンフリーな水が必要でしたら限外濾過法を行った水が必須です。ただ、普通のCOSとかHEKとかの動物細胞培養でしたら2次蒸留水でも十分です。蛍光検出用のマイクロアレイなんかは限外濾過水が必須なようです。

超純水は十数MΩ・cmの水のことです。MilliQはミリポア社の超純水装置を用いて作った水で比抵抗は15MΩ・cm以上と高純度の水です。MilliQに関してはイオン交換樹脂を通し、逆浸透法、限外濾過法を用いて精製しているようです。

>また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
これに関しては上で書いたように限外濾過膜で精製した水です。MilliQが当てはまるでしょう。(超純水も一般的には限外濾過をしているのでこれも当てはまりますかね。)

>動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?
これは、2次蒸留水以上の純度があれば十分です。2次蒸留水、MilliQ水、超純水が使用できます。

ただ、水関係の装置は日頃のメンテナンスが重要でイオン交換樹脂とか水を貯めるタンク、蛇口に汚染がないかは確認する必要があります。

実験書には必ずはじめのほうに書いてあることですので、pinokoBBさん自身でなにか実験書をご参照ください。

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は...続きを読む

QDNAシーケンスでのBigDye で使うポリメラーゼ

実験初心者です。DNAのシーケンシングを行う際に、Big Dye 3.1 というものを入れ、それに目的のDNAとプライマーを入れた溶液を作製し、PCRを行いました。ここで疑問が出てきたのですが、PCRを行う際にはDNAポリメラーゼが必要ですよね? 普通のPCR反応ではポリメラーゼを別に加えるのにここでは加えていません。Big Dye の溶液の中に含まれているのでしょうか? 調べてもBig Dye に含まれる成分が全く出てこなかったので、困っています。もしDNAポリメラーゼが含まれているなら、何の生物由来のものかなども分かると嬉しいです。

Aベストアンサー

BigDyeの詳細な組成は公開されていませんが
ポリメラーゼが含まれているのは
間違いありません。

種類も公開されていませんが
おそらくΔTthか その類だと思います。

Qプライマーの希釈について

これからPCRを行う初心者です。
プライマーを合成してもらい、乾燥状態で届きました。
まずこのプライマーを100μMの濃度にするように言われました。添付文書に27nmolとあったので270μlの水で溶かせばいいのでしょうか?
PCRには0.2mMで使用したいのですが、100μMにした後、どのように希釈してよいのかわかりません。
計算がわからないので教えてください。
よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

>添付文書に27nmolとあったので270μlの水で溶かせばいいのでしょうか?

正解です。100 μMは100 pmol/μLです。27 nmol=27000 pmolなので、270 μLに溶かせばよいです。

>PCRには0.2mMで使用したいのですが、100μMにした後、どのように希釈してよいのかわかりません。

0.2mMは200 μMです。100 μMの濃度の倍ですから希釈ではできません。
なにより、0.2 mMは濃すぎます。勘違いでは?

プライマーは薄めすぎると分解しやすいので100 μMでストックするとして、当座使う分は10倍に薄めて10 μM (10 pmol/μL)にしておきます。これをPCR反応50 μLあたり1.0~2.5 μL(終濃度0.2~0.5 μM)使うくらいが相場だと思いますが。


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