stacking gelとrunning gelでTris-HClのpHを変えるのはのはなぜですか?
おしえてください。

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A 回答 (4件)

ためしにと思って入れるトリスバッファーストックを両方6.8で


行ったら界面がでこぼこになりました。

よく考えると、ストックが8.8が1.5M、6.8が0.5Mなので
本当に反対にしているわけではなく、トリス濃度の影響かもしれませんが

界面をしっかりするという働きもあります
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rei00 です。


補足拝見しました。私も akiyamaharuka さんの意見に賛成ですので,ご自分で成書をご覧下さい。

 と,補足要求しておいてこれでは何ですから,私の手元の成書(最新 電気泳動実験法,日本電気泳動学会 編集,医師薬出版株式会社)の記載を簡単に紹介しておきます。

【stacking gel に関して】
 ・・・試料の pH が 6.8 からはずれると,電気泳動時の濃縮効果が悪くなり,バンドの幅が広がってしまい分解能は低下する。・・・

【running gel に関して】
 ・・・SDS-PAGE は,・・・・ポリペプチドが SDS と結合して分子量によらず一定の移動度をもつことを利用して分子量を測定する方法である。・・・


 詳細は akiyamaharuka さんもお書きの様に,ご自分で参考書などをご覧になって下さい。そうすれば,他の事も目に入りますので,多くの勉強ができます。皆そうやって知識を増やしてきたのですよ(akiyamaharuka さん,そうですよね)。
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gelの名前がそのまま理由です。


電気泳動で分離するためには同時にスタートして、流れた距離で
分離をします。どうしてもゲルにアプライするときに高さ(スタート位置が
ずれる)がでますのでスタッキングのあいだに濃縮(言葉ができとうかわかりませんが)して、同時にrunnning gelに流し込むわけです。
chargが変わるとなぜそうなるかは、岩波や化学同人の実験シリーズの
電気泳動やタンパクの本に必ずでていますので、参考に(大学の図書館ならまずあるはずです)。
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 少し質問がわかり難いですので,以下の点について補足いただきたいと思います。



 ご質問になっているのは,western blotting でなく,電気泳動の事のように思いますが,よろしいでしょうか?もしそうだとしたら,どの様なタイプの電気泳動でしょうか?SDS-PAGE でしょうか?

 stacking gel と running gel の Tris-HCl の pH を補足下さい。私の手元にある成書には,それぞれ 6.8 と 8.8 となっていますが,同じでしょうか?

この回答への補足

失礼しました。SDS-PAGEのことです。pHの値もおなじです。

補足日時:2002/01/22 18:43
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QSDS-ゲル電気泳動

SDS-ゲル電気泳動で、サンプル試薬をウェルにアプライするのですが、このサンプル溶液にグリセロールが入っていると実験書に書いてありました。
これは試薬をアプライしたときに試薬が拡散せずに下に落ちていくのに関係しているらしいのですが、これは何故なのか詳しく教えてください。お願いします。

Aベストアンサー

sarurujiさんこんにちは。
簡単に言うと比重の問題です。
SDSでもアガロースでも電気泳動の際にはゲルを泳動用のbuffer中に浸した状態で流しますね。

その際ウエルが解放状態にありますので、当然アプライしたサンプルはbuffer中に
拡散しようとします。グリセロールはこれを防いでくれます。

グリセロール以外にシュクロースなどを用いたりもしますが、用は糖を高濃度で加えて
比重を重くしているわけです。

しかし、サンプルが20とか30とかになると、アプライしている最中に僅かながら拡散が始まったり、
ゲルに浸透し始めてしまうので、大量のサンプルを扱うときはパラフィルムなどの疎水シート上で
グリセロールや泳動用色素とサンプルをミックスして並べてから一気にアプライします。(既にやってるかもしれませんが)

QTris-Hcl緩衝液について

酵素実験で、緩衝液としてTris-Hclを使用するのですが、
これはどのような仕組みでpHの変化を弱めているのすか?
なるべく詳しく教えていただけるとありがたいです。
あと、Trisって何ですか?

Aベストアンサー

 Tris の正式名称は ADEMU さんが回答されていますが,この化合物の別名に「tris(hydroxymethyl)aminomethane」があります。「Tris」の名はこの最初の部分に由来しています。

 緩衝液を作るときに,Tris-HCl と Tris を混ぜませんでしたか? Tris-HCl[ (HOCH2)3C-NH3(+)・Cl(-) ]が弱酸で,Tris[ (HOCH2)3C-NH2 ]が弱塩基であるため,これらの混合溶液が緩衝作用を示します。

 緩衝液の作用の仕組みは過去質問の「QNo.66844 緩衝液のしくみについて」(↓1番目)が参考になるかと思います。

 さらに,OK Web のトップページ(↓2番目)で「緩衝液」,「バッファー」,「buffer」等を検索すると関連質問がいくつもヒットします。

参考URL:http://www.okweb.ne.jp/kotaeru.php3?q=66844, http://www.okweb.ne.jp/search.php3

Q電気泳動のゲル

電気泳動の基礎的なことですが,質問させてください.
単純に考えると,電気泳動は電荷を持った粒子に電界中において移動させるものと思っております.このとき粒子が電気泳動する媒体(アクリルアミドゲルなど)は絶縁体なんですか?それとも導体とか電解質とかなんですか?
キャピラリー電気泳動なんかで,もしゲルが絶縁体だったら,キャピラリーがくねくねしていると電界が掛からないだろうし,導体だったら電流が流れてしまうし,電解質だったらゲル自体が電気泳動してしまうんじゃないかと思いました.
よろしくお願いします.

Aベストアンサー

ゲル担体は電気的に中性と考えてよいです。
ゲルを満たしているバッファーは電導性です。

ゲル担体は「ふるい(篩)」として働きます。電荷によって移動する物質を、ふるいの通り抜けやすさで分離しているのです。分子量が大きいほどふるいの網目を通り抜けにくくなり、立体構造が網目に引っかかりやすいほど通り抜けにくくなります。

核酸の電気泳動、タンパク質のSDS-PAGEでは、分子量と電荷が比例するので、ゲル担体(ふるい)がなければ分子量にかかわらず同じ速度で移動します。
ゲルというふるいがあり、分子量が大きいほど通り抜けにくくなるので、分子量に応じた分離ができるわけです。

Q化学 38%HCl溶液から20%HCl溶液を180mL調製したい。36%HCl溶液は何mL必要か?ま

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計算不能です。
いわゆるパーセント濃度は質量パーセント濃度。水溶液の質量に対する溶質の質量の割合を示しています。
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Q電気泳動は何のためにするのでしょうか

米の品種判別実験でDNA抽出精製してからPCRをかけその後電気泳動するのですが、PCRはDNAが複製するんですよね、コレをやり電気泳動をすることで何がわかるのでしょう、また電気泳動は何をするため使われるんでしょうか

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例えば、農薬Aに対して、それを分解することで耐性を持つ品種を作るとすると、その品種が農薬A分解酵素を作るようにしてやればいいですよね。
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上で組み込まれた遺伝子が増幅するようにプライマーを作ってPCRをすれば、改良された品種ではその部分が増幅されます。これに対して、その他の品種では何も増幅されないか、あるいは非特異的な増幅が起こります。
よって、PCR産物を電気泳動したときに、ある決まった長さ(プライマーデザインからあらかじめ分かっている長さ)のPCR産物が確認できれば、農薬Aの耐性を持つように品種改良されていることが分かります。

Q酢酸緩衝液 HCl pH計算

タイトルのような問題があるのですが、
解法から全く分かりません。

どなたかやり方を教えていただけないでしょうか。

『0.1mol/L CH3COOH 16mlと、0.1mol/L CH3COONa 4mlを混ぜ、
この混合溶液に0.1mol/L HClを1ml加えたときのpHを求めよ。
ただし、酢酸緩衝液のpKaを4.74とする。』

回答よろしくお願いします。

Aベストアンサー

酢酸のpKaが4.74ということですよね?
これは、酢酸の解離平衡
AcOH ⇔ AcO- + H+
において、
[AcO-][H+]/[AcOH]=10^(-4.74) ・・・(1)
が成り立つということです。[ ]で囲んでいるのはモル濃度のことです。
また、簡単のために酢酸をAcOH、酢酸イオンをAcO-と記載しています。

HClを加える前の状態を考えると、合計の体積は20mlなので、酢酸
および酢酸イオンの濃度はそれぞれ
0.1*16/20=0.08
0.1*4/20=0.02
と(計算上は)なります。計算上と断っているのは、解離平衡がずれること
によってこれらの濃度は変わってしまうからです。ただ、両者の合計値が
変わることはありません。よって、
[AcO-]+[AcOH]=0.1 ・・・(2)

また、溶液全体として電荷は±ゼロになるので、
[AcO-]+[OH-]=[Na+]+[H+]
ここで[Na+]は上記の酢酸イオンと同じ計算で0.02mol/Lです。この
濃度は変わることはありません。よって
[AcO-]+[OH-]=[H+]+0.02
[AcO-]=[H+]-[OH-]+0.02 ・・・(3)

次に、水のイオン積より
[H+][OH-]=10^(-14)
[OH-]=10^(-14)/[H+] ・・・(4)

ここで(4)を(3)に代入してもいいのですが、この溶液は酸性であると予想され、
[OH-]<10^(-7)なので、0.02に比べて極めて小さくなります。よって
(3)は
[AcO-]=[H+]+0.02 ・・・(3)’
と近似できます。これを(2)に代入すると
[H+]+0.02+[AcOH]=0.1
[AcOH]=0.08-[H+] ・・・(2)’

(2)’と(3)’を(1)に代入して
[H+]([H+]+0.02)/(0.08-[H+])=10^(-4.74) ・・・(1)’
これは[H+]の二次方程式になり、地道に解くと6.85*10(-5)に
なるのですが、これは0.02や0.08に比べて極めて小さい値なので
(1)’は
0.02[H+]/0.08=10^(-4.74)
[H+]=4*10^(-4.74)
pHにすると≒4.1となります。

次に、HClを加えた場合ですが、(1)は変わりません。
[AcO-][H+]/[AcOH]=10^(-4.74) ・・・(1)

(2)については、全体の体積が21mlになるので、
[AcO-]+[AcOH]=2/21 ・・・(2)

(3)は、新たに塩素イオンが加わるので
[AcO-]+[OH-]+[Cl-]=[Na+]+[H+]
[Na+]=0.1*4/21=0.4/21
加えたHClは全量解離するので
[Cl-]=0.1*1/21=0.1/21
よって
[AcO-]+[OH-]+0.1/21=[H+]+0.4/21
[AcO-]=[H+]-[OH-]+0.3/21 ・・・(3)

(4)は変わりません。

ここからは、HClを加える前の場合と同じで、(4)を(3)に代入しても
いいのですが、今回はより酸性サイドなのでやはり[OH-]は極めて
小さく、
[AcO-]=[H+]+0.3/21 ・・・(3)’
と近似できます。これを(2)に代入すると
[AcOH]=2/21-[AcO-]
      =1.7/21-[H+] ・・・(2)’

(2)’と(3)’を(1)に代入して
[H+]([H+]+0.3/21)/(1.7/21-[H+])=10^(-4.74) ・・・(1)’
これも二次方程式を地道に解いてもいいのですが、
[H+]は0.3/21や1.7/21に比べて極めて小さいので、(1)’は
0.3[H+]/1.7=10^(-4.74)
[H+]=5.67*10^(-4.74)
pHにすると≒4.0ですね。

pKaの値から、pHは大体4から5前後だと予想できるので、HClを加える前の
計算は別にしなくてもいいと思いますが、一応確認のためやっときました。
計算を簡略にするためにどういう近似を使うかがポイントです。

酢酸のpKaが4.74ということですよね?
これは、酢酸の解離平衡
AcOH ⇔ AcO- + H+
において、
[AcO-][H+]/[AcOH]=10^(-4.74) ・・・(1)
が成り立つということです。[ ]で囲んでいるのはモル濃度のことです。
また、簡単のために酢酸をAcOH、酢酸イオンをAcO-と記載しています。

HClを加える前の状態を考えると、合計の体積は20mlなので、酢酸
および酢酸イオンの濃度はそれぞれ
0.1*16/20=0.08
0.1*4/20=0.02
と(計算上は)なります。計算上...続きを読む

Q電気泳動でのバッファー選択

ふと思ったのですが、アガロースゲル電気泳動ではTAEを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動ではTBEを使うのはなぜなのでしょうか?

Aベストアンサー

文意からするとDNAの電気泳動のようなので以下のURLを参考にしてください。
緩衝溶液の種類によって分離能が変わってくるようです。一般的に2種類の緩衝剤を混合して緩衝溶液を調製すると2箇所のpH領域で緩衝能を持ちますが、TAEやTBEの場合、そのような理由では用いられてはおらず、pH調整用に酢酸やホウ酸を加えているのでしょうね。

参考URL:http://bio.takara.co.jp/catalog/qa.asp?ID=53

Q10mM HClのpH

10mM HClのpHを知りたいです。理論的に算出可能でしょうか?

Aベストアンサー

>>1Nリン酸、1N酢酸、1N硫酸を用いてpH.2.0 50mLの溶液の計算過程を教えてください

まず簡単なほうから

(1)1N H2SO4
硫酸は2価の酸だから 1Nは2Mに等しい。
pHが2になるとき[H(+)] = 1×10^(-2) = 0.01M
この濃度のH(+)を生じる硫酸の濃度はその半分で0.005 M
したがって2Mを稀釈して0.005Mにすればよいので、400倍稀釈。
つまり1N H2SO4を0.125 mlを取って、これに水を加えて50mlにすればよい。

(2)1N HAc (酢酸をこのように書きます。Ac=CH3COO)
HAc ⇔ H(+) + Ac(-)   Ka = 1.75×10^(-5)

ここからはNo.2の式 x^2/c = Kaで計算してみて下さい。
1N HAcを稀釈してpH = 2にするのは不可能なようです。なぜなら、1N (c=1)の酢酸の場合、x^2/c = Kaから、
x (= [H(+)] = 4.18×10^(-3)
よって pH = -log(4.18×10^(-3)) = 2.38
つまり稀釈しなくてもpHが2より高いので、1Nの原液を稀釈してpH = 2にすることは不可能です。

(3)1M H3PO4
問題には1Nリン酸と書いてありますが、弱酸の場合、規定濃度はあまり使わないような気がします。
塩酸、硫酸のような強酸ならば、1Mの濃度の酸から1Mあるいは2MのH(+)が生じるのでモル濃度÷価数=規定濃度となりますが、弱酸の場合はそうなりません。したがって規定濃度はあまり意味がないように思います。
そこで、問題には1Nと書いてあるのですが1Mだと思って回答いたします。(たぶん、それでよいと思います。)

H3PO4 ⇔ H(+) + H2PO4(-)   Ka1 = 7.5×10^(-3)

前に言いましたが、第二、第三段階の電離は、Kaが5桁ずつ小さいので、第一段階の電離に比べて無視できます。したがって、上の電離式だけで考えます。
回答No.2の式 x^2/(c-x) = Kaの式に数値を代入してみます。
pH = 2ならば[H(+)] = 1^10^(-2)、これがつまりxの値です。
リン酸の場合は酢酸の場合より、ちょっと厄介です。酢酸の場合はKaが小さい(10^(-5)のオーダー)ので良かったのですが、リン酸の場合Kaがこれよりかなり大きくなります。((10^(-3)のオーダー))。これくらい電離度が高くなると、c-x = cという近似が成り立たなくなるのです。
そこでx^2/c = Kaではなく、x^2/(c-x) = Kaの式を使います。
(簡単に言うと酸の初濃度(はじめに加えた濃度、つまり見かけの濃度)と電離して平衡に達したときの酸(電離しないで分子として残っている酸)の濃度を同一視して良いかどうか、という問題です。)

x^2/(c-x) = Kaの式に数値を代入すると、
c = 0.023 M

したがって1Mのリン酸を稀釈して0.023Mにすればよい。
稀釈倍率は43.48倍。よって1Mの原液1.15mlを取って、これに水を加えて50mlにすればよい。

ちなみに、c-x = xの近似を用いると、c = 0.013 Mとなって、誤差が出ることがわかります。

No.4の答え(0.013M)も、この近似式で計算したので、こうなりました。0.023Mの方がより正しいようですね。

近似計算は、なかなか難しいです。Kaが10^(-5)のときはc-x = xの近似ができて、10^(-3)のときはダメなんですね。迷うときは x^2/(c-x) = Kaを使えばよいでしょう。計算は面倒になりますが。。。

あまり上手な説明ができなくて、ごめんなさい。
おわかりになったでしょうか。

>>1Nリン酸、1N酢酸、1N硫酸を用いてpH.2.0 50mLの溶液の計算過程を教えてください

まず簡単なほうから

(1)1N H2SO4
硫酸は2価の酸だから 1Nは2Mに等しい。
pHが2になるとき[H(+)] = 1×10^(-2) = 0.01M
この濃度のH(+)を生じる硫酸の濃度はその半分で0.005 M
したがって2Mを稀釈して0.005Mにすればよいので、400倍稀釈。
つまり1N H2SO4を0.125 mlを取って、これに水を加えて50mlにすればよい。

(2)1N HAc (酢酸をこのように書きます。Ac=CH3COO)
HAc ⇔ H(+) + Ac(-)   Ka = 1.75×10^(-5...続きを読む

Q電気泳動の正確さ

電気泳動のことで質問なのですが、電気泳動はどれくらい正確に測ることができるのでしょうか。教えてください。

Aベストアンサー

ゲルの状態(濃度・均一性)によって若干ずれたりしますので、
精度はその時々によって異なる…というのが実感です。

また、ゲルの端と中央で温度差が生じると、サンプルの移動に影響があります(「スマイル」と言われていて、「( 」←こんな感じになります。)
誤差を防ぐためには
・ゆっくりと(50Vで)サンプルを流す、
・両端のレーンはできるならば使わない ほうが良いみたいですね。

Q1.25[mol/L]HClのpH?

何度も質問ばかりですいません。
突然友達に以下の問題を教えてくれと頼まれたのですが、ぶっちゃけ分かりません(爆) 

問;1.25(mol/L)のHClのpHはいくらか?

以下、僕の回答です。
HClの電離度は1なので、[H+]=1.25(mol/L)になりますよね?だからpH=-log[H+]に代入したんです。そしたらpH=-0.0969になっちゃいました!これって絶対おかしいですよね。でもどうやって考えたらよいのか分からないのです。どなたかご教授お願いします。

Aベストアンサー

どうして絶対におかしいと思ってるのかな?
pHは0から14までの値になるって思ってるのかな?
そんなことないですよ。
pHは負の値になることもあるし、14を越えることもあります。
だから貴方の出した値で正しいです。


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