動物細胞へのベクターの導入原理について、悩んでいます。
「プラスミドは自己増殖能を持つ」という記述があるのですが、
動物細胞内にベクターとして導入した場合、プラスミドのままタンパクを合成する能力を持つのでしょうか?
それとも、核内のDNAに組み込まれて目的タンパクを合成するようになるのでしょうか?
生物の知識はかじった程度で、実験等を進めてきたのですが、
イマイチはっきりとしない箇所が多く、迷っています。
助言を得られたら、非常に幸いです。

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A 回答 (1件)

こんにちは。


 哺乳類細胞にプラスミドを導入すれば、プラスミドに組み込んだ遺伝子からタンパクを発現させることができます。しかし哺乳類細胞中ではプラスミドは増殖しませんので、一過性の発現しか得られません。
 核内のDNA、つまりゲノムに組み込むためには、レトロウィルスベクターを使う必要があります。この方法ではレトロウィルスに目的の遺伝子を組み込んで哺乳類細胞に感染させ、その遺伝子を宿主細胞のゲノムに組み込んでしまいます。もちろん目的の遺伝子からタンパクの発現が得られます。しかし、現実的にはウィルスの感染効率が悪かったり、しばらくするとタンパクの発現が落ち込んでしまったり、といった問題があります。

この回答への補足

有益な助言ありがとうございます。
ところで、補足の質問となってしまうのですが、プラスミドベクター中にウィルス由来の(例えばSV40)等の遺伝子が組み込まれている場合には、ウィルスベクターを用いるのと同じような効果が得られるということなのでしょうか?
ベクターの説明書きには、transient transfection及びstable transformantに用いることが出来ると書いてあります。
私の場合には一過性トランスフェクションしか行わないのですが・・。

それから、トランスフェクション後にタンパクの発現量が減ってことが、良く観察されたのですが、その理由が分かったのが大変ありがたかったです。

補足日時:2002/01/24 16:19
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Qpoly-Aとは

poly-Aとはなんでしょうか?
あとpoly-A付加シグナルについても教えてください。

Aベストアンサー

プロセッシングが完了し完成したmRNAの3'末端には、50~200塩基ほどのアデニン(A)ヌクレオチドが付加されています。これがpoly-A tailです。poly-A tailはmRNAに安定性をあたえ、翻訳を促進する働きがあると考えられています。

mRNAは、まず遺伝子のプロモーターからエクソン、イントロンを含め連続的に転写され、転写の終結部は最後のエクソンよりかなり下流に及びます(真核生物では転写終了位置を示すシグナル配列のようなものは見つかっていません)。
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poly adenylationは、最終エクソン内のAAUAAAという配列(polyadenylation signal ポリアデニル化シグナル, poly-A additional signal ポリA付加シグナル)を認識するpoly-A polymerase ポリAポリメラーゼによって行われます。この酵素はポリアデニル化シグナルの10~30塩基下流で一時転写産物を切断するとともに、鋳型に依存せずにアデニンを付加します。なお、ポリアデニル化シグナルには例外も知られています。

参考URL:http://opbs.okstate.edu/~melcher/MG/MGW2/MG234.html

プロセッシングが完了し完成したmRNAの3'末端には、50~200塩基ほどのアデニン(A)ヌクレオチドが付加されています。これがpoly-A tailです。poly-A tailはmRNAに安定性をあたえ、翻訳を促進する働きがあると考えられています。

mRNAは、まず遺伝子のプロモーターからエクソン、イントロンを含め連続的に転写され、転写の終結部は最後のエクソンよりかなり下流に及びます(真核生物では転写終了位置を示すシグナル配列のようなものは見つかっていません)。
この一時転写産物はイントロンを削除しエクソンを連...続きを読む

Qプラスミドについて ご存知の方お願いします!

プラスミドマップについて質問させてください。今後プラスミドを扱う大学院生です。
初歩的なことですみません。

マップ内にcodingされている遺伝子のうち、転写の向きが異なるものが含まれていることがあるかと思うのですが、これはまず総論的な話として

1、意図的にあえてそうしたものを作っているのか、そうだとすればそれはなぜなのか
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お忙しいとは思いますがサイトや本を見てもしっくりくるものがなくて非常に困っています、よろしくお願いします!

Aベストアンサー

次にいつ書き込めるか分からないので答えておきますね。
実験用途と照らし合わせて考えると良いと思います。

・動物細胞などに使う発現ベクターやT3/T7/SP6 promoterのベクターでインサートの向きが反対
=アンチセンスRNAを発現、またはin vitroで合成させるために作った可能性があります。
線虫などを研究対象にしている場合、その可能性は高いと思います。
Mammalianを対象にした時期もありましたが、RNAiの仕組みが分かった今とあっては…使えませんね^-^;
(ESでは有効という話も聞きますが、詳しくは知りません)

几帳面な人がハズレクローンを保存してただけかも知れません。。


・クローニングベクターのLacZとインサートの向きが反対
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クローニングベクターにもT3/T7/SP6 promoterがあったりするので
こうなってくると単純にクローニングしただけなのか、意図的にそうしたのか、見分けはつかないと思います。

またベクター構築の際、MCSを拝借したりするために、機能上全く意味のない中間体ベクターを作ることがありますので、
使途不明のベクターは詮索してもあまりメリットはないと思います^-^;

次にいつ書き込めるか分からないので答えておきますね。
実験用途と照らし合わせて考えると良いと思います。

・動物細胞などに使う発現ベクターやT3/T7/SP6 promoterのベクターでインサートの向きが反対
=アンチセンスRNAを発現、またはin vitroで合成させるために作った可能性があります。
線虫などを研究対象にしている場合、その可能性は高いと思います。
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Q抗原抗体反応について

ウエスタンブロット法による特異的たんぱく質の検出反応を先日行ったのですが、一次抗体、二次抗体をもちいて反応を行いました。

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一次抗体は特異的たんぱく質を抗原として認識し結合します。二次抗体は一次抗体の定常部位を抗原として認識し結合します。ポリクローナル抗体は一つの抗原たんぱく質の複数の場所に結合しますから、一次抗体と二次抗体を使うと、一次抗体の結合した場所に一次抗体よりも多くの二次抗体が結合することになります。つまり、二次抗体を使う方が特異的たんぱく質の検出感度を上げる事ができるということです。

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QW/V%とは?

オキシドールの成分に 過酸化水素(H2O2)2.5~3.5W/V%含有と記載されています。W/V%の意味が分かりません。W%なら重量パーセント、V%なら体積パーセントだと思いますがW/V%はどのような割合を示すのでしょうか。どなたか教えていただけないでしょうか。よろしくお願いいたします。

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Q原核生物と真核生物の違い

原核生物と、真核生物の違いについて教えてください(><)
また、ウイルスはどちらかも教えていただけると嬉しいです!

Aベストアンサー

【原核生物】
核膜が無い(構造的に区別出来る核を持たない)細胞(これを原核細胞という)から成る生物で、細菌類や藍藻類がこれに属する。

【真核生物】
核膜で囲まれた明確な核を持つ細胞(これを真核細胞という)から成り、細胞分裂の時に染色体構造を生じる生物。細菌類・藍藻類以外の全ての生物。

【ウイルス】
濾過性病原体の総称。独自のDNA又はRNAを持っているが、普通ウイルスは細胞内だけで増殖可能であり、ウイルス単独では増殖出来ない。



要は、核膜が有れば真核生物、無ければ原核生物という事になります。

ウイルスはそもそも細胞でなく、従って生物でもありませんので、原核生物・真核生物の何れにも属しません(一部の学者は生物だと主張しているそうですが、細胞説の定義に反する存在なので、まだまだ議論の余地は有る様です)。



こんなんで良かったでしょうか?

Q原核生物と真核生物

原核生物と真核生物の遺伝情報発現機構の相違点について分かることがあれば教えて下さい。

Aベストアンサー

結構たくさんあるのですが。

まず、転写。原核生物も真核生物もはRNAポリメラーゼがDNAを転写しますが、原核生物はイントロンを含まないmRNAができます。真核生物はエキソン(タンパク質コードする領域)とイントロン(コードしない領域)を含むmRNA前駆体なるものを作ります。この前駆体はスプライシングという操作を受けて、イントロンが切り離されます。さらに、5'末端にキャップ構造を、3'末端にアデニンがたくさん連なったpolyAを付加されます。これで真核生物のmRNAが完成します。

原核生物は核を持たないので細胞質で直接転写が行われ、その場でリボソームにより翻訳されます。しかし、真核生物は核で転写が行われるため、リボソームが翻訳をするためには核の外にmRNAが出ないといけないのです。キャップ構造は、核の外に出ていいよというシグナルの役割を果たすといわれています。

また、原核生物ではひとつのmRNAが複数の関連のあるタンパク質を同時にコードしているポリシストロン性が見られますが、真核生物では通常ひとつのmRNAからは一種類のタンパク質しかできません(モノシストロン性)。原核生物はこうして複数のタンパク質を同時に発現することですばやく環境に適応できます。

非常に簡単な説明でしたが、詳しいことはご自分でお調べになってくださいな。がんばってください!

結構たくさんあるのですが。

まず、転写。原核生物も真核生物もはRNAポリメラーゼがDNAを転写しますが、原核生物はイントロンを含まないmRNAができます。真核生物はエキソン(タンパク質コードする領域)とイントロン(コードしない領域)を含むmRNA前駆体なるものを作ります。この前駆体はスプライシングという操作を受けて、イントロンが切り離されます。さらに、5'末端にキャップ構造を、3'末端にアデニンがたくさん連なったpolyAを付加されます。これで真核生物のmRNAが完成します。

原核生物は核を持た...続きを読む

QプラスミドDNAの抽出法

実験でプラスミドDNAの抽出をアルカリ法によって行いましたが、アルカリ法の原理がわかりません。
自分でも調べてみましたが、原理はわかりませんでした。
原理をココで教えてくれる方、良いHPを知っている方、何か教えていただけると幸いです。

Aベストアンサー

菌を適当なバッファーに再懸濁します(グルコースが入っているのが一般的ですが、浸透圧をあわせるだけで、あまり重要ではありません)。

アルカリとSDSでタンパク質や膜成分を可溶化し溶菌します。同時に大腸菌のゲノムDNAはアルカリ変性して一本鎖状態になります。スーパーコイル状のプラスミドは変性しにくいのでそのまま残ります(プラスミドまで変性しないように冷やしたり、短時間にします)。

そこに酢酸カリウムなどの塩を加えると急激に中和されるのと同時に塩析作用で、タンパク質-SDS複合体と変性DNAを不溶化します(冷やすこと、時間を置くことで沈殿の形成を促します)。これを遠心分離すると上澄みにプラスミドが残ります。

塩を含んだ上澄みにアルコールを加えると溶けていたプラスミドがアルコール沈殿を起こすので、これを遠心分離して沈殿として回収します。70%程度のエタノールで沈殿から塩を洗い流します。

Qプラスミド精製の原理

大腸菌からプラスミドを取り出す(精製)の
原理を簡単にいうとどんな感じですか?

今はキアゲンのキットを使っているので
いまいち原理がつかめません。
塩化セシウム、ボイル法とかありますが、
教科書を読んでもいまいちピンきません。

簡単に教えていただけませんか。

Aベストアンサー

1.大腸菌のサスペンションにアルカリ溶液を入れる
(大腸菌の膜が壊れて、タンパクやDNAなどが出てくる。DNAはアルカリで変性して一本鎖になる)

2.酸で中和する
(変性したタンパクなどは析出、長いゲノムDNAは中和で二本鎖に戻ろうするが、長いので絡まって析出。プラスミドDNAは小さいので二本鎖に戻って溶液中に存在)

3.遠心分離して上澄みを回収
(タンパクや絡まったゲノムDNAなどは沈殿、上澄みにあるプラスミドDNAを回収)

4.昔は(10年前の記憶だと)、フェノール・クロロホルムで、残りのタンパク質・脂質などを除く。
(脂質はフェノール層へ、DNA・RNAは水層へ、タンパク質は中間層へ分離するので、水層を回収)

5.その後、イソプロパノールでDNA・RNAを沈殿させる。(イソプロパノールでDNAの水和水が取られて、DNAが不溶化して沈殿する)

6・RNA分解酵素でRNAを分解して、もう一度フェノール抽出をして、エタ沈(イソプロと同じ原理)して、その沈殿を回収するとプラスミドDNAが得られる。

キアゲンは、4のところで、カラムにかけると、DNAが樹脂に結合するので、bufferで不要なものを洗い流して、最後にpHを変えると、プラスミドDNAは溶出されてきます。キアゲンのホームページからマニュアルをダウンロードすれば、詳しく書いてありますよ。

1.大腸菌のサスペンションにアルカリ溶液を入れる
(大腸菌の膜が壊れて、タンパクやDNAなどが出てくる。DNAはアルカリで変性して一本鎖になる)

2.酸で中和する
(変性したタンパクなどは析出、長いゲノムDNAは中和で二本鎖に戻ろうするが、長いので絡まって析出。プラスミドDNAは小さいので二本鎖に戻って溶液中に存在)

3.遠心分離して上澄みを回収
(タンパクや絡まったゲノムDNAなどは沈殿、上澄みにあるプラスミドDNAを回収)

4.昔は(10年前の記憶だと)、フェノール・クロロホルム...続きを読む

Qベクターとプラスミドと形質転換

ベクターとプラスミドって何が違うんですか?
意味的にはほとんど同じだと思うんですが。

形質転換で大腸菌に入れて増やしますが形質転換の時に導入した物と同じものが得られるんですよね?

形質転換によってプラスミドはどれくらい増えるものなのですか?

Aベストアンサー

こんばんは。
もう答えは出ておりますので、補足を少しします。

プラスミドベクターはハイコピーの物とローコピーの物があります。
一つの細胞内(ここでは大腸菌一体の事をさします)。で増えるプラスミドの量はベクター内の複製起点及びそ周辺のDNAシークエンスによって異なります。

pUC、pBR系などの有名なハイコピーベクタープラスミドの複製起点はColE1をアレンジした配列が含まれており、一細胞内で500程度のコピー数になります。

それに反してpACYC系に見られるローコピーベクタープラスミドはp15の様な複製起点が厳密に定義されている物はコピー数が少ないです。
これによって一細胞内でのコピー数は20-30程度です。
この様に考えますとベクターコピー数も収量に大きく関与するファクターと言えます。

No.1さんは恐らくハイコピープラスミドベクターのオーバナイトカルチャーの事をご指摘されているのだと思います。

下らない補足、失礼致しました。

QDNAとゲノムDNAの違い

DNAとゲノムDNAの違いを教えてください。
遺伝子とDNAの違いはわかるのですが、上記の2つについてはわかりません。
よろしくお願いします。

Aベストアンサー

ゲノム
http://ja.wikipedia.org/wiki/%E3%82%B2%E3%83%8E%E3%83%A0

DNA
http://ja.wikipedia.org/wiki/DNA
DNAは化学的な物質名で人口に合成した化学物質でも、その化学的構造を持っていればDNAといいます。

ゲノムDNAの定義はよく分かりませんが、真核生物などはミトコンドリアなどにもDNAがあり、それと区別してゲノムDNAといえるかもしれません。また、ウイルスが感染しいて、染色体以外にDNAが存在する時、両者を区別するのにそういう表現ができると思います。


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