動物細胞へのベクターの導入原理について、悩んでいます。
「プラスミドは自己増殖能を持つ」という記述があるのですが、
動物細胞内にベクターとして導入した場合、プラスミドのままタンパクを合成する能力を持つのでしょうか?
それとも、核内のDNAに組み込まれて目的タンパクを合成するようになるのでしょうか?
生物の知識はかじった程度で、実験等を進めてきたのですが、
イマイチはっきりとしない箇所が多く、迷っています。
助言を得られたら、非常に幸いです。

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A 回答 (1件)

こんにちは。


 哺乳類細胞にプラスミドを導入すれば、プラスミドに組み込んだ遺伝子からタンパクを発現させることができます。しかし哺乳類細胞中ではプラスミドは増殖しませんので、一過性の発現しか得られません。
 核内のDNA、つまりゲノムに組み込むためには、レトロウィルスベクターを使う必要があります。この方法ではレトロウィルスに目的の遺伝子を組み込んで哺乳類細胞に感染させ、その遺伝子を宿主細胞のゲノムに組み込んでしまいます。もちろん目的の遺伝子からタンパクの発現が得られます。しかし、現実的にはウィルスの感染効率が悪かったり、しばらくするとタンパクの発現が落ち込んでしまったり、といった問題があります。

この回答への補足

有益な助言ありがとうございます。
ところで、補足の質問となってしまうのですが、プラスミドベクター中にウィルス由来の(例えばSV40)等の遺伝子が組み込まれている場合には、ウィルスベクターを用いるのと同じような効果が得られるということなのでしょうか?
ベクターの説明書きには、transient transfection及びstable transformantに用いることが出来ると書いてあります。
私の場合には一過性トランスフェクションしか行わないのですが・・。

それから、トランスフェクション後にタンパクの発現量が減ってことが、良く観察されたのですが、その理由が分かったのが大変ありがたかったです。

補足日時:2002/01/24 16:19
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Q遺伝子導入

遺伝子導入について詳しいページはないでしょうか?
遺伝子導入の原理や発現させるための注意点を
知りたいのですが…。

Aベストアンサー

こーゆーのはどう?
TAKARAバイオ株式会社というメーカーのホームページ
http://www.takara-bio.co.jp/
商品検索(サーチ)で「遺伝子導入」と検索してみると商品説明が詳細に出てきます。
たとえばレトロウイルスをつかった遺伝子導入について原理、キット使用上の注意点などがでてきます。

Q培養細胞へのアデノウイルスベクター導入

カチオニックリポソームですと、だいたい80~90%コンフルエント時にtransfectionしますよね。
adenovirusを使用する場合、細胞の濃度は発現効率に差が出てきますでしょうか。
やはり、ある程度コンフルエントになってから導入すべきなのでしょうか。
ちなみに、目的はあるがん抑制遺伝子を導入し、その後培地中のVEGF濃度を測定するというものです。

Aベストアンサー

リポソーム法によるtransfectionは細胞が死にやすいこともあって、細胞密度が高い方が効率がいいことがあります。
ウイルスを感染させる場合は、ウイルスのtiter(力価)が重要です。titerが低ければ細胞密度が高いと、感染した細胞の割合は全体の細胞から見て低くなります。titerが低い場合はポリブレンという化合物を感染時、一緒に加えると1桁くらいあがります。

感染の効率を上げたいのなら、細胞は少ない方がいいと思います。

Q遺伝子導入 リポフェクトアミン

リポソームを用いた遺伝子導入方について質問します。

現在、インビトロジェンから発売されている「リポフェクチン」や「リポフェクトアミン」を用いて遺伝子導入しようと考えているところなのですが、導入したいDNAは、環状のままよりも、直鎖化した方が導入効率が高いのでしょうか? 

近くにこの試薬を用いたことのある人がいないのでアドバイスお願いします。

Aベストアンサー

ちょっととらえ方をまちがえていると思います.

直鎖化するのは,ゲノムに組み込むためです.環状・直鎖が遺伝子導入効率に大きな影響を与えることはないと思いますよ.

SV40T遺伝子がすでに導入されたセルライン(COS7や293T)にsv40-oriを含んだプラスミドをトランスフェクションすると,導入した細胞内でプラスミドは増幅できます.だからタンパク質を高発現できます.

このとき,環状ではなく直鎖化しておくとそれがおこりません.この状態でG418などの薬剤でセレクションすると,生存できる細胞は必然的にゲノムにプラスミドがインテグレートした細胞のみになるはずです.



と,ここまで書いて思ったのですが環状のほうが質問者様の意図にあうと思います.トランスフェクションの効率はあまり差がないですが,環状だとその後増幅しますから,遺伝子導入効率が高いのと同じですよね.

Q"浮遊細胞"の細胞増殖率を、なるべく簡単に測定したいのですが、

"浮遊細胞"の細胞増殖率を、なるべく簡単に測定したいのですが、

どのような方法があるでしょうか?

Aベストアンサー

特別な設備が無いなら、一定時間ごとにサンプリングして
血球計算盤でカウントするのが一番簡単だと思いますよ。

Q最適な遺伝子導入試薬が見つからず、困っています。。。

現在、私は培養細胞に遺伝子導入するため、遺伝子導入試薬の選択を行っています。
今までは論文や書籍(羊土社)を参考に、扱っている細胞への導入実績がある試薬について導入を試してきました。
実験上細胞核内まで遺伝を送達させたいのですが、どの導入試薬も細胞質でとどまってしまっている印象を受けています。
勉強不足とは承知の上で質問させて頂きますが、有効と思われるような遺伝子導入試薬をご存じの方はいらっしゃいませんか?
ちなみに今まで試した試薬はLipofectamine系, Oligofectamine, FuGGENE 6, HDなどなどです。

Aベストアンサー

細胞とその状態、導入するDNAの種類とその精製度合い、
などによるのでその情報がないために、何とも言えません。

あと、遺伝子導入後、どのくらいの時間で、どのようなチェックの仕方で発現していないとおっしゃっているのかもわからないので、何とも言えません。

>細胞質でとどまってしまっている印象を受けています。
こう思う理由も私にはわかりません。

なので一般論として、

細胞についてですが、もともと浮遊細胞は付着細胞に比べて導入しづらいです。また、同じ細胞でも、実験者の飼い方によって結果が大きく異なります。細胞の状態が悪いと、遺伝子導入時に死んでしまいます(うまく導入された細胞ほど)。

次に、導入する遺伝子ですが、大腸菌から精製した発現ベクターを使っている場合、大腸菌からのLPS等のコンタミは細胞にかなり悪影響を及ぼします。経験上、ミニプレップで精製したDNAはよくない気がします。

ベクターは何であれ、遺伝子によってその産物が細胞に悪影響があれば結果として発現している細胞が見かけ上いなくなります。積極的にアポトーシスを誘導しなくてもです。(まぁGFP単体を発現するような系でもチェックされていると思いますが)

発現のチェック方法ですが、付着細胞の場合はウエスタンでもFACSでもかなり効率よく発現が確認されることも多いと思います。
しかし、初心に返って使っている抗体がちゃんとワークしているか確認は必要なときもあります。

浮遊細胞の場合は、ウエスタンで発現がチェックできるほど発現が高くないかもしれません。FACSにおいて、発現していない細胞に比べて10~100倍くらい明るい細胞が10%としかいないこともザラにあります。

以上が思いつく一般論です。あまり細かいことは言えないと思いますが、
ある程度情報がないとコメントしづらいと思います。

細胞とその状態、導入するDNAの種類とその精製度合い、
などによるのでその情報がないために、何とも言えません。

あと、遺伝子導入後、どのくらいの時間で、どのようなチェックの仕方で発現していないとおっしゃっているのかもわからないので、何とも言えません。

>細胞質でとどまってしまっている印象を受けています。
こう思う理由も私にはわかりません。

なので一般論として、

細胞についてですが、もともと浮遊細胞は付着細胞に比べて導入しづらいです。また、同じ細胞でも、実験者の飼い方に...続きを読む

Q恋愛:単細胞動物と多細胞動物の分かれ目

 ふとしたことで疑問がわきました。
 まず、人間の恋愛について。人間って十人十色です。いろんな特徴をもつ人がいます。それで、自分に似ているところがあったり、あるいは自分にないものをもっている人に無意識のうちに惹かれて結びつき、子孫を残します。人間はさまざまな人がさまざまな個性に惹かれて結びつきます。
 人間の祖先のおサルさんの仲間たちや、鳥や動物も、求愛して振られたり成功したりしながら子孫を残します。
 そうしてどんどん下っていくと、単細胞動物に行き着きました。「単細胞」動物は、いったいどのようにパートナーを選んで子孫を残すのか?人間にとっては何の代わりもないどんぐりの背比べのような単細胞動物のように見えてはいるのだが、実は単細胞動物たちはそれぞれ違いがあるのか?(外国人が日本人を見るとみな同じ顔【目が一重で切れ長、平面顔】に見えるよというが、実は日本人って二重も一重もイロイロある、というように。単細胞動物だって、「同じように見えるかもしれないけど、実は、オレたち、イロイロあるんだよ」って思っているかもしれない・・。)単細胞動物はどのようにパートナーを「選択」するのでしょうか??誰でもいいんだけど、ちょうどタイミングよく近くにいたから結合したとか、その程度なのでしょうか?
 そうすると、恋愛という面からみると、単細胞動物と多細胞動物の分かれ目ってどこにあり、どの動物から多細胞動物と呼べるのでしょうか?
 ※なるべくなら、専門家の方か、専門誌などでこのことについて読んで知ってますって方の回答をお聞きしたいです。

 ふとしたことで疑問がわきました。
 まず、人間の恋愛について。人間って十人十色です。いろんな特徴をもつ人がいます。それで、自分に似ているところがあったり、あるいは自分にないものをもっている人に無意識のうちに惹かれて結びつき、子孫を残します。人間はさまざまな人がさまざまな個性に惹かれて結びつきます。
 人間の祖先のおサルさんの仲間たちや、鳥や動物も、求愛して振られたり成功したりしながら子孫を残します。
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Aベストアンサー

こんにちは。
単細胞でも「接合」という有性生殖を行なう場合があります。
私たち人間に例えればつまりHですね。
卵子と精子で受精するのではなく、1個の細胞同士が合体してDNAを交換して離れてゆき、それぞれ別々に分裂を始めます。

この場合、どっちがオスでどっちがメスか判りませんが、雌雄が分化している場合でもしていない場合でも「近所にいる」「相手も適齢期(細胞が接合する時期)」である事が絶対条件となります。

つまり我々の「遠距離恋愛」や「国際結婚?」は成立しないかも。(爆)

Q遺伝子導入について

遺伝子組み換えなどにおいて行われる遺伝子導入の操作で、
目標となる細胞に導入された遺伝子はどうなるのでしょうか?
その細胞の中のほかの遺伝子と同じように扱われ、
うまくいけばその細胞の中で働くことになるのでしょうか。
また、その細胞が増えるとき(増えるものであれば)、一緒に複製されていくのでしょうか。

もしかすると、遺伝子の働く仕組み自体が理解できていないのかもしれません。
基本的な原理から解説いただければと思います。よろしくお願いします。

Aベストアンサー

まず、遺伝子を細胞に「導入」という言葉についてですが
この言葉は少し曖昧です。

実験的に遺伝子を導入した後には

遺伝子が

「核内に入る」

「核内のDNAに組み込まれる」

少なくとも2つの状態があります。

そのことを念頭においての説明です。

遺伝子であるDNAから、最終的にタンパク質が作られて
それが機能するのですが(例外もありますが)、
そのためには、プロモーター領域が必要となります。
プロモーターとは、DNAからmRNA(これによりタンパク質ができる)が作られるのに必要な領域です。

実験的には、プロモーターと遺伝子をつないだ状態で細胞に導入することがあります。
この場合、「核内に入れば」そのプロモーターによってその遺伝子が発現することになります。
しかし、細胞分裂してしまうと、そのプロモーターと遺伝子をつないだものは
細胞あたりの数が減ってしまいます(細胞分裂する前に複製されないからです)。
また、核内に浮遊しているので、細胞外に排出されることもしばしばあります。

結果として、導入された遺伝子は失われることになります。

それに対して、実験的に、遺伝子を細胞に導入した後、核内に入った遺伝子の中で
(詳しい原理はよくわかりませんが)、細胞の「核内のDNAに組み込まれる」ものがあります。

この場合で、プロモーターと遺伝子をつないだものを導入していれば、
そのプロモーターに依存してタンパク質がつくられることになりますし、

もし、プロモーターをつないでない場合は、
遺伝子が核内のDNAに組み込まれたところにあるプロモーターによって
導入した遺伝子からタンパク質が作られることになります。
また、細胞分裂においても、核内のDNAに組み込まれているので、
細胞の遺伝子と一緒に複製されて、娘細胞もその遺伝子を持つことになります。

>うまくいけばその細胞の中で働くことになるのでしょうか。

はい、うまくいけば働くことになります。

まず、遺伝子を細胞に「導入」という言葉についてですが
この言葉は少し曖昧です。

実験的に遺伝子を導入した後には

遺伝子が

「核内に入る」

「核内のDNAに組み込まれる」

少なくとも2つの状態があります。

そのことを念頭においての説明です。

遺伝子であるDNAから、最終的にタンパク質が作られて
それが機能するのですが(例外もありますが)、
そのためには、プロモーター領域が必要となります。
プロモーターとは、DNAからmRNA(これによりタンパク質ができる)が作られるのに必要な領域です。

実験...続きを読む

Q一般に動物細胞というけれど、動物のすべての組織は同じ細胞で作られているんですか?

ふと疑問に思ったことがあります。動物細胞と植物細胞の作りを学校で学びますよね。この動物細胞ですが、動物には脳や眼球、内臓にリンパ腺、筋肉など、いろいろな器官がありますが、すべて同じ細胞で構成されているのですか?すべての細胞は同じ遺伝情報を持っているのは知っていますが、細胞はどうなんでしょうか?学校ではただ動物細胞と植物細胞の2つしか習わないので疑問に思いました。ネットで検索してみましたが何も見つけられませんので、ご存知の方がいらっしゃればぜひ教えてください。

Aベストアンサー

引き続き
なかなか的を得た回答では無いかもしれませんが・・・

一般に習う動物細胞は、その特徴の一部を模式的に表したものです。細胞は多様ですので、まったく同じ構造ではありません。あくまで特徴なので、細胞壁が無かったり、葉緑体が存在していなかったり、などなどです。

ちなみに、神経細胞=ニューロンではありません。
ニューロンは神経単位で、主となる神経細胞にシュワン細胞などが巻きついた構造の単位です。調べてみてください。

確かに質問者さんが不思議に思われるのも納得できます。
最初は1つの受精卵から始まり、分裂を繰り返し細胞数を増やしながらも、位置情報を元に、異なる遺伝子が発現し、細胞が分化していくのです。その過程においてトランスポゾンなども関与しながら発現するので、DNA(ゲノム)レベルでは違いが出てくるとも考えられます。

現在再生医療の研究が盛んで、iPS細胞の作成は可能になっています。後は組織を作るための位置情報のコントロールの仕組みが明らかになれば、完全な臓器や体の部位の再生も可能となるでしょう。

質問者さんが疑問に思うように、一言に動物細胞といっても、様々な細胞が構造の細胞があります。その細胞が集まって組織を形成しています。その組織がかつまり一定の働きをする器官を構成し、この器官があつまり一つの個体として成り立っています。その一つの個体が形成されるまでの発生の過程における「分化のしくみ」が面白いところです。

引き続き
なかなか的を得た回答では無いかもしれませんが・・・

一般に習う動物細胞は、その特徴の一部を模式的に表したものです。細胞は多様ですので、まったく同じ構造ではありません。あくまで特徴なので、細胞壁が無かったり、葉緑体が存在していなかったり、などなどです。

ちなみに、神経細胞=ニューロンではありません。
ニューロンは神経単位で、主となる神経細胞にシュワン細胞などが巻きついた構造の単位です。調べてみてください。

確かに質問者さんが不思議に思われるのも納得できます。
最初は1...続きを読む

Q植物(イネ)への遺伝子導入について

現在イネへの遺伝子導入を行っている学生です。

例えばアグロバクテリウムを使って
イネへ特定の遺伝子導入を行った場合
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では、その遺伝子が組み込まれたイネを自殖した場合、
その種子からは
4分の1で、その遺伝子が2対の染色体両方に組み込まれたイネ
2分の1で、2対のうち1対だけに組み込まれたイネ
さらに4分の1で遺伝子が組み込まれていないイネができるのでしょうか?
後、つまり遺伝子が機能を有するのは4分の3で、のこりの4分の1は
遺伝子が組み込まれていないため発現しなくて、
ふつうのイネと変わらないのでしょうか?

とても、疑問に思っていますが知り合いもよく分からないそうで
投稿しました。
宜しくお願いします。

Aベストアンサー

あなたのおっしゃるとおり、形質転換により染色体にT-DNAが1つだけ入った場合はメンデルの法則に従い、次世代は1:2:1の比率で分離します。つまり、全体の約1/4の個体は野生型となります。ただし、T-DNAが2つ以上挿入された場合はこのような分離比にはなりません。

QSiRNAとプラスミドベクターとのライゲーション

SiRNA(2本鎖のオリゴ)をプラスミドベクターに挿入しようと思ってます。
そこでライゲーションの方法ですが、普通にT4DNAリガーゼを使ってもできますでしょうか。
プラスミドはDNAですが、挿入するのはSiRNAなのです。
いかがでしょうか。

Aベストアンサー

RNAの場合は下に回答がありますので、
siRNAをコードするDNAだった場合について。

もしもオリゴDNAを自分で発注して、
アニールさせてインサートとして入れるのであれば、
通常のオリゴDNAは末端にリン酸基がついていないので、
(注文すれば有料でつけてくれますが)
そのままの状態で、
ベクター側をアルカリフォスファターゼ処理しているとライゲーションされません。

ベクター側を制限酵素処理後に、
アルカリフォスファターゼ処理しないで、
セルフライゲーションが出ないものを用意しておくか、
(スタッファーDNAが入っていないベクターの場合は特に注意が必要です)

インサート側をPNKなどでリン酸化する必要があります。


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