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いつもお世話になっています。
タンパク質を厚さ1mmのゲルでSDS-PAGEした後、Bio Radのセミドライ式のブロッティング装置でニトロセルロース膜に転写しています。

Bio Radのホームページに、原則として15・20kDaより大きいタンパク質の時はporeサイズ0.45μm、それ以下であれば0.2μmの膜を使うようにとありました。
うちの研究室にあるニトロセルロース膜は0.2μmなのですが、目的タンパク質は約110kDaなのです。
それって問題ないのでしょうか?
12.5%のゲルの時に、50kDa以上のタンパク質の転写効率が良くないのですが、そのせいもあるんでしょうか?
ちなみに転写バッファーにはCAPSのバッファー(pH11)を用い、メタノールが10%入っています。
トリス-グリシンのバッファー(pH8.3)の方が良いでしょうか?

うちの研究室は学生が勝手に試薬や備品の購入ができないので、先生に指摘する前に、0.2μmでは駄目なのか知りたいと思い質問しました。
よろしくお願いします。

A 回答 (1件)

ポアサイズが大きいと低分子量のタンパク質が通り抜けやすいので、ターゲットが低分子のときは小さいポアサイズのものを選べということですね。

高分子量がターゲットのときに、小さいポアサイズのものを使っていけないということはないと思います。

デメリットがあるとすれば、非特異的なバンドが検出されやすくなることがあるというところでしょうか。ニトロセルロースよりPVDFのほうがタンパク質の捕捉力が高いのですが、前者では検出されなかった非特異的バンドが後者では検出されるということは良くあります。まあ、これは前者ではタンパク質のロスがあるために非特異的なバンドのシグナルが弱くなっているということでしょうが。

低分子のブロットの効率が低くなるのはメンブレンを通り抜けてしまうからですが、高分子が転写されにくいのは、ゲルからの移動度が低くなるからです。これはメンブレンを変えても改善しません。高分子用に最適化した転写バッファー(成書やブロット装置の説明書を参照してください)を使うとか、低電圧・長時間の転写をすると向上します。
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この回答へのお礼

ありがとうございました。
0.2μmでも問題ないとのことで安心しました。
全部やり直し、とか厳しいものがありますから・・・

バッファーは色々試してみます!

お礼日時:2006/05/11 16:29

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