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試薬・分析用水等、最善の条件で検量線を作成すればその検量線を次回の分析にも使用できるのではないでしょうか?次回の分析も同様の条件とします。詳しい方ご指導下さい。

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A 回答 (5件)

 私も、『モル吸光係数が分かっているのに』と感じたことがあるのですが・・・。



 次が最大の理由です。
 機械のチェックになる。機械は、いつかボツになります。内部のミラーが曇っていて、性能が出なかった経験があります。
 検量線くらいしか、正常に動作しているか否か判断する方法が無いのでは。普通は、検量線がOKであることを確認してから、試料の測定にかかります。後から検量線をチェックして、『駄目だった』ことが分かって、測定のやり直しは、うんざりします。
 学生だと、「ハイ、やり直し」というと、「サンプル捨てました」なんぞのとんでもない返事をくれますが。

 検量線にもよります。どこの機械で測定しても同じ値になるハズものは、またいつ測定しても誤差が少ない環境なら、可能でしょう。

 しかし、私は、次の理由からも、毎回検量線を引きます。
1) 検量線を引くための準備は、6本ほど余分に試験管を使うだけだから、それほどの手間ではないこと。2) 検量線によって、その日の自分の調子が分かること。3) 可視部は色が見えますが、紫外部は見えないので、試薬の入れ忘れのチェックになる。

 蛍光分析や発光分析では、ランプやフォトマルの消耗度などにより、同じ機械でさえ経時的に劣化し、値が違うので、毎回検量線を作成する必要があります。
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No.2である。

付けたしをさせて頂く。

重要なキーワードは、再現性である。検量線を作成したときと完璧に同一の環境が続くのであれば、再現性はあることは既に述べたが、環境はちょっとしたことで変化するので、完璧に同一の環境を保持することは現実には不可能である。

No.3の方は温度で容器の体積が変化することを挙げておられる。もちろんこのことにも注意する必要はあるが、それ以上に液体の体積変化のほうが大きいので一層の注意が必要である。

メスフラスコに適当な溶媒二種類混合してメスアップして密閉し、放置しておくと微妙な温度変化による体積変化がどれほどのものかを実感できる。例えば、100mLのメスフラスコにヘキサンを50mLを入れ、酢酸エチルでメスアップした物を用意する。このとき一気にメスアップすると希釈熱を奪われて混合液の温度がやや下がる。それを室温まで戻すと、液面が標線よりもずっと上に来るのが分かるだろう。温度が室温まで上がったことによって膨張したのである。

膨張前の1.0000mLと膨張後の1.0000mLでは、含まれる分子のモル数が違うのである。なのでこれら二つを「別物」なのである。

もちろん、事前の調査でこれらの膨張が分析値に多大な影響を与えないことが分かっていれば、液の膨張を気にすることはない。例えば、膨張前の1.0000グラムと膨張後の1.0000グラムに含まれる分子数は有効数字5桁の範囲で同じであるので、体積ではなく重さでサンプルをはかりとる分析手法ならば膨張は問題とはならない。

このように温度変化は分析値に多大な影響を与えることがある。したがって分析室の温度管理は非常に大切であり、本当に厳密な環境を求められる場合には、分析機器が発する熱量なども考慮のうえ、部屋の広さや高さ、空調の吹き出し口の場所と向き、分析機器の設置場所が決められている。人間も余計な熱源のひとつなので、注意が必要である。
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この回答へのお礼

ありがとうございます、なかなか難しいものですね

お礼日時:2006/07/26 22:19

ものによりけり。



けんりょうせんをいくつか作って.信頼限界を求めて(できますよね).どの程度重なるかを見てください。
極端な場合.連続して投入しなかった試料の場合には.けんりょうせんを作り直さないとまったく異なる値が゜でる場合があります。
これは.検出限界の1/10を定量しようとするむちゃくちゃな実験でしたが。

温度に注意してください。外気温の変化で容器の大きさが変化します。これを補正しておかないとめちゃくちゃになったのが.今はほとんど使われていない軟質ガラスせい軽量機。機械によっては25度すぎるとめちゃくちゃな結果を出す場合があって.クーラーがなかった当時.夏は一切使わないという方法しか対応がありません手゛下。
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>最善の条件で検量線を作成すればその検量線を次回の分析にも使用できるのではないでしょうか?



ラフな分析であれば、十分使えるであろう。

ただし、厳密な分析をする場合には、検量線にも“賞味期限”が定められているので使うことは出来ない。

極端な話、検量線は測定前だけに作成するものではない。検量線作成→検体分析と進む場合、検体分析中に環境が変わり、検量線が真値と合致しなくなるケースが起こり得る。こうしたドリフトの有無を確認するために、検体分析後にあらためて検量線を作成しなおし(あるいは検量線作成に用いたスタンダードをいくつか分析し)、検体分析前に作成した検量線と合致することを確認する作業が必要になる。

分析室の温度や湿度の微妙な変化によって影響を受ける分析方法は多い。気温の変化は溶液の体積を変動させるので、誤差の原因となりやすい。

>次回の分析も同様の条件とします。

厳密には、完全に同じ条件と言うのは有り得ない。どの程度の誤差を許容できるかによって「同様」とみなせる範囲が変わってくる。

大切なことは、何をどうすれば何がどれだけずれるのかを事前に確認しておくことである。

分析のバリデーションに関して調べてみると色々な知見が得られるであろう。
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毎回毎回、最善の条件での測定が可能な分析系であればそれで構わないと思いますよ。



しかし、実際問題として、測定毎にまったく同じ条件で測定するのが困難な分析系も存在します。

要するに、「次回の分析も同様の条件とします」という条件がきちんと出来ればそれでいいのですが、それが出来ないことが多いということです。

経験的に毎回同じ検量線が書けるというのであれば、検量線は数ヶ月に1度とかでも構わないかもしれませんし、複数点を測定しない「1点検量線」を用いるのも手かもしれません。
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Q検量線

検量線とはどういったものなのか?
検量線を引くとはどういったことをすればいいのかおしえてください。

Aベストアンサー

masazo27さんの2番煎じとなりますが、改めて説明を試みたいと思います。
検量線を引くとは、測定器の固有差を見極め、その固有差を見極めた上で、未知試料について正確な測定を行うことを目的にしています。
例えば、ある水溶液中の砂糖の濃度を知ることが目的であるとします。砂糖の濃度を知ることが目的の検量線とは、砂糖0.1g、0.2g、0.3gをそれぞれ1Lの水に溶かし(あらかじめ濃度が既知の試料を作成し)、それを測定器にかけ、測定器の指示値を記録します。それを、横軸を濃度、縦軸を指示値にとったグラフ用紙に記入し、直線なり曲線で結びます(直線か、曲線かは理論的なものに依存します)。こうしてできたラインが検量線です。この検量線により、測定器の実際の指示値から濃度を推定できるようになります。ただし、検量線は濃度0.1~0.3g/Lの間で作成したので、その検量線の有効性もその間と言わざるを得ません。検量線から推定して1.5g/Lとでた場合には、その値の信憑性は低いと言わざるを得ないでしょう。その際は、O,1.0,2.0g/Lの既知試料等で検量線を引き直す必要があると思います。

masazo27さんの2番煎じとなりますが、改めて説明を試みたいと思います。
検量線を引くとは、測定器の固有差を見極め、その固有差を見極めた上で、未知試料について正確な測定を行うことを目的にしています。
例えば、ある水溶液中の砂糖の濃度を知ることが目的であるとします。砂糖の濃度を知ることが目的の検量線とは、砂糖0.1g、0.2g、0.3gをそれぞれ1Lの水に溶かし(あらかじめ濃度が既知の試料を作成し)、それを測定器にかけ、測定器の指示値を記録します。それを、横軸を濃度、縦軸を指示値にとったグラ...続きを読む

Q吸光光度法の検量線について

検量線を作成し、データーにばらつきが生じた場合はどのようにすべきなんでしょうか。無理やり線でつなぐのかなと思っているのですが・・回答をお願いします。

Aベストアンサー

 検量線を引くための標準液は、0を含めて、6点取っています。標準液を調製しやすいように、例えば、0、1、2、3、4、5 mg/mlなど。これを5点検量(0は、普通対照に利用するので)と称しています。4点の場合もあります。
 基本は、グラフを書いて、1点がヅレていたら、それは無視して検量線を引く。2点ズレテイタラ、こりはヒドイので、やり直す、と言うのが教科書です。

 正確にするために検量線を2連(2回)して、その平均を取る、というバカな教えをする教員もいますが(それなら、2連より10連、100連の方が正確、と毒づいています)。
 
 実験のテクニックが難しくて、全体がばらつく場合もあります。この場合は、5点ではなく、10点とか、測定する回数を増やしたりして、信頼性を高めるしかありません。検量線は、もちろんパソコンで引きます。また、サンプルの測定も、一回だけではなく、数回測定して、平均値を去る必要があります。

 化学反応は、バラツキマセン。しかし、生物のサンプルは、個体差があるので、最低3回は測定して、平均と標準偏差を示します。例えば、血糖値を測定するときに、血液中のグルコースの測定は、ばらつかないので1回で十分。しかし、A、B、Cサンそれぞれの値は異なるので、ヒトの血糖値となると、最低3人は測定しなければなりません。
 同じサンプルを測定して、値がばらつくのは単に腕が悪いだけです。学生だと5%程度、慣れると2%以内、分析のプロだと0.5%の誤差でもウルサク言います。
データがばらつく原因を考え、検量線とサンプルの測定回数を決めてください。

>無理やり線でつなぐのかなと思っているのですが
測定した点をつないだりしているのでしょうか。それはヤリマセン。昔は、測定した点の近くをなるべく通る直線(場合によっては曲線)を、慣れを頼りに引いていました。今ではパソコンがあるので、回帰式を出します。これが検量線になります。最近は、機器に検量線を自動的に描き、濃度まで計算しているのが、普通です。
 回帰式の相関係数が、0.98以上あれば信頼していますが、0.95だとやり直すかどうか迷います。

 検量線を引くための標準液は、0を含めて、6点取っています。標準液を調製しやすいように、例えば、0、1、2、3、4、5 mg/mlなど。これを5点検量(0は、普通対照に利用するので)と称しています。4点の場合もあります。
 基本は、グラフを書いて、1点がヅレていたら、それは無視して検量線を引く。2点ズレテイタラ、こりはヒドイので、やり直す、と言うのが教科書です。

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Q検量線について

発光強度を測定して物質の濃度を求めています。
毎回検量線を作っているのですが、実験を行うたびに検量線の式が(傾き、切片)違ってきます。
8点取るうち、r2=0.99以上になる範囲を使って濃度を求めているのですが、間違いですか?
0.99以上になる範囲は毎回違います。3点だったり、5点入ったり、上下も違います。
教えてください。

Aベストアンサー

>同一のものを2回測定とは?常に2連で行っていますが、いみないですか?
検量線の点数と精度は関係ないですか?

何点とるかは、研究者次第です。もちろん、点数が多ければ多いほど、平均化されるので、精度(バラつき)は上がります。が、確度(真の値にどれだけ近いか)は、無関係です。極端な話ですが、100と出るところを、50と出た場合、50に近い値がでて、平均値は50になっても、測定を何度繰り返しても、100に近づくことは無いでしょう。

 検量線の点は、それ自体に誤差を含んでいます。ですから、検量線の点は、点ではなく、その点を中心に、縦の(y軸方向の)誤差を表す短い線が見えないだけです。その線の長さは、その人の腕がよければ短く、悪ければ長いのです。

 ですから、「検量線は、なるべく点の近くをとおるように引け」ということになります。各々点は、絶対的に正しいものではなく、誤差を含んでいるのです。5点もとれば、その誤差を考慮した、もっともらしい検量線が引け、十分と考えるのが一般的でしょう。
 少なくとも、私はそう考えていて、検量線を2連引け、3連とれ、なんぞの指導も耳にしますが、それなら、5連、10連、いや100連でもとったらどうだ、反論するのですが。
 
 繰り返しになりますが、標準液から検量線を引いた場合、その全体を採用するか否かです。バラつきが多過ぎる(相関係数が、小さすぎる)と判断すれば、やり直します。
 その中から、気に入った点だけを採用する、というのは誤りです。もっとも、先に述べたように、グラフにしたあと、明確に1点が外れている、という場合はその点を外して、検量線を引くことは許されています。

 最少、なぜ5点必要かといえば、1点が外れる場合を想定しているからです。例えば、0を除いて、3点しかとっていないと、1点は明確な誤りだとして外すと、残りは2点になります。そうすると、0と点が2つ合計3点で、直線が引けないことはないのですが、自信がもてません。
 実際に、任意の3点を描き、それで検量線を引いて下さい。どうですか。もう一点、加えると信用度が格段にUPしませんか。

 蛍光の場合は、直線ではなく、縦軸を対数にすると、相関係数が高くなったりします。蛍光なら、0.95程度でも使用できるのでは。

 検量線が引けないのは、測定法自体に問題がありませんか。特に、バックグランドが高いと(下駄が高いとも表現します)、その影響が大きすぎることがあります。このような場合、前処理をすることが一般的です。

>同一のものを2回測定とは?常に2連で行っていますが、いみないですか?
検量線の点数と精度は関係ないですか?

何点とるかは、研究者次第です。もちろん、点数が多ければ多いほど、平均化されるので、精度(バラつき)は上がります。が、確度(真の値にどれだけ近いか)は、無関係です。極端な話ですが、100と出るところを、50と出た場合、50に近い値がでて、平均値は50になっても、測定を何度繰り返しても、100に近づくことは無いでしょう。

 検量線の点は、それ自体に誤差を含んでいます。ですから、検量...続きを読む

Q検量線の計算方法について

こんにちは。
現在HPLCを扱っております。検量線を使っているのですが
計算方法がよく理解できておりません。
【化粧品100g中に有効成分Aは何g含まれているか】を求めるものです。
まず、
標準品 0g、0.1g、0.3g、0.5g を精密に量り、全て精製水で正確に
100mlとします。この各液から、さらに1mlを精密に量りとり、精製水を
加えて正確に100mlとします。

試料は 1mlを精密に量り、精製水を加えて正確に100mlとしました。

ピークのAREAですが【標準品】
0.1g→ 574221
0.3g→ 1671182
0.5g→ 2717212
【試料AREA】は1738876 です。
Excelで検量線の計算式を出したところ下記のような式になりました。
y=5E+06x + 46962  R2 =0.9998

この場合、100g中に何g含まれているかを求めるには
どうしたらいいのでしょうか?
私なりに計算して四捨五入で0.3gとなったのですが
あっているでしょうか?

長くなってしまいましたが、教えてください!

こんにちは。
現在HPLCを扱っております。検量線を使っているのですが
計算方法がよく理解できておりません。
【化粧品100g中に有効成分Aは何g含まれているか】を求めるものです。
まず、
標準品 0g、0.1g、0.3g、0.5g を精密に量り、全て精製水で正確に
100mlとします。この各液から、さらに1mlを精密に量りとり、精製水を
加えて正確に100mlとします。

試料は 1mlを精密に量り、精製水を加えて正確に100mlとしました。

ピークのAREAですが【標準品】
0.1g→ 574221
0.3g→ 1671182
0.5g→ 27...続きを読む

Aベストアンサー

ちょっと整理するために長くなりますが、順番に書きますね。

1.まず検量線に用いた標準溶液の濃度をきちんと計算しましょう。
○標品 0g、0.1g、0.3g、0.5g
 →mgに換算すると0mg, 100mg, 300mg 500mg
○全て精製水で正確に100mlとする
 →濃度は0mg/ml, 1mg/ml, 3mg/ml, 5mg/ml
○1mlを量りとり精製水を加え100mlとする(100倍希釈)
 →濃度は0mg/ml, 0.01mg/ml, 0.03mg/ml, 0.05mg/ml
 →μgに換算すると0μg/ml, 10μg/ml, 30μg/ml, 50μg/ml

2.計算した濃度(μg/ml)を横軸xに、HPLCで得られた面積の値を縦軸yにしてグラフを描きます(エクセルならば散布図ですね)。
この時、0μg/mlの試料を分析したときの値も使いましょう(ピークが出ないのならば、面積は0とする)。

3.近似式を追加して検量線の式を計算させると、
   y = 54291x + 19103  R2 = 0.9997
となります。

4.これで検量線ができたので、未知試料を分析したときのピーク面積1738876をyの部分に代入して計算します。

5.xの値として31.6769...(μg/ml)と出てきます。

6.この値はあくまでも"分析した試料"の濃度です。目的としている化粧品1mlを100mlに希釈したものがこの濃度であることから、化粧品中の濃度は100倍して約3158(μg/ml)となります。mgやgに換算しなおすと、それぞれ3.2mg/ml、0.0032g/mlとなります。

7.もし【化粧品"100ml"中に有効成分Aは何g含まれているか】ということならば、単純に濃度に100mlをかけて、0.32gとなります。
ここで注意が必要なのは、【化粧品"100g"中に有効成分Aは何g含まれているか】となっていることです。厳密には100mlと100gは同じ量を表していません。化粧品100mlの密度(g/ml)が分かればこの値を0.32にかければ【化粧品"100g"中に有効成分Aの量】が出せます。密度が不明なときは、例えば100mlを正確に量り取ってから、その質量を精密天秤で測ってください。質量÷体積で密度が計算できます。

ちょっと整理するために長くなりますが、順番に書きますね。

1.まず検量線に用いた標準溶液の濃度をきちんと計算しましょう。
○標品 0g、0.1g、0.3g、0.5g
 →mgに換算すると0mg, 100mg, 300mg 500mg
○全て精製水で正確に100mlとする
 →濃度は0mg/ml, 1mg/ml, 3mg/ml, 5mg/ml
○1mlを量りとり精製水を加え100mlとする(100倍希釈)
 →濃度は0mg/ml, 0.01mg/ml, 0.03mg/ml, 0.05mg/ml
 →μgに換算すると0μg/ml, 10μg/ml, 30μg/ml, 50μg/ml

2.計算した濃度(μg/ml)を横軸xに、HPLCで得られた面...続きを読む

Q吸光度の単位

吸光度の単位は何でしょうか!?
一般的には単位はつけていないように思われるのですが。。
宜しくお願いします。

Aベストアンサー

物理的には、No.1さんも書かれているように吸光度も透過度も基本的に同じ単位系の物理量どうしの「比」なので「無単位」です。しかし、無名数では他の物理量、特に透過度と区別が付かないので、透過度は"透過率"として「%」を付けて表し、"吸光度"は「Abs(アブス)」を付けて呼ぶのが業界(分析機器工業会?)のならわしです。

Q統計学でいうRSD%とは何ですか。

統計学でいうRSD%の平易な説明と計算方法を知りたいのですが。標準偏差はわかります。

Aベストアンサー

RSD%とは、相対標準偏差をパーセントで表示したものと思われます。

相対標準偏差(%)=(標準偏差/平均値)×100

次のページは、「相対標準偏差 RSD 平均値」で検索して出たものの一つです。
http://www.technosaurus.co.jp/product/mlh_faq_sd1.htm

参考URL:http://www.technosaurus.co.jp/product/mlh_faq_sd1.htm

Q分光光度計での測定手順

分光光度計である溶液の濃度を測定しています。
人によって二つのやり方があることが分かり、どちらが正しいかを検討しています。
ちなみにダブルビームです。
(方法1)
・キュベットAとBに水を入れてゼロ補正
・次にキュベットAにブランク、キュベットBにサンプルを入れて吸光度の差を測定する。
(方法2)
・キュベットAに水、キュベットBにブランクを入れてゼロ補正
・次にキュベットAに水、キュベットBにサンプルを入れて測定。
・ブランクとサンプルのそれぞれの吸光度の差を計算する。

どちらでも良いという人と、差があるようだという人と分かれています。どなたか教えてください。

Aベストアンサー

以前、分光光度計の設計をやっていました(早い話、作る方のプロでした)。

操作上のミスや誤差を抜きにして言えば、装置的には優位な誤差に違いは
ないように思いますが、分光光度計の設計者が想定している使用方法は、
きっと(方法1)ですね(ひょっとして私だけだったらごめんなさい)。

関係しそうなポイントをいくつか挙げておきます。

1.ゼロ補正は、再現可能性の高いものを基準として実施した方が良い。
  つまり、今日も明日も明後日も、特別なアクセサリを使用せず、
  いつものキュベットで普通の水溶液で吸光度測定をする限り(有機溶媒
  系で測定とかでなく)、試料Aを測定するにも試料Bを測定するにも、
  いつも0Absの基準は同じものにするのが望ましいです。そのためには、
  "常に同じ"蒸留水同士で取るのがベターと考えます。

2.ダブルビームの分光光度計は基本的に、サンプル溶液とブランク溶液
  の比をリアルタイムで測定することを前提に設計しています。
  (きっとどのメーカーも)

ただし、これは作る側の立場で考えていることなので、使う側の方が
「こちらの方が理屈でも経験上でも良い結果が出る」ということであれば、
決してそれを否定するものではありません。
特に、分光光度計の設計者の多くは物理屋であり、使う方々の多くはきっと
化学屋さんである点は要注意かも知れません。

以前、分光光度計の設計をやっていました(早い話、作る方のプロでした)。

操作上のミスや誤差を抜きにして言えば、装置的には優位な誤差に違いは
ないように思いますが、分光光度計の設計者が想定している使用方法は、
きっと(方法1)ですね(ひょっとして私だけだったらごめんなさい)。

関係しそうなポイントをいくつか挙げておきます。

1.ゼロ補正は、再現可能性の高いものを基準として実施した方が良い。
  つまり、今日も明日も明後日も、特別なアクセサリを使用せず、
  いつものキ...続きを読む

QW/V%とは?

オキシドールの成分に 過酸化水素(H2O2)2.5~3.5W/V%含有と記載されています。W/V%の意味が分かりません。W%なら重量パーセント、V%なら体積パーセントだと思いますがW/V%はどのような割合を示すのでしょうか。どなたか教えていただけないでしょうか。よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

w/v%とは、weight/volume%のことで、2.5~3.5w/v%とは、100ml中に2.5~3.5gの過酸化水素が含有されているということです。
つまり、全溶液100ml中に何gの薬液が溶けているか?
ということです。
w/v%のwはg(グラム)でvは100mlです。

QまたまたHPLCで教えてくださいな!

えっと、HPLCのベースラインのことでお尋ねします。

ズバリ、ベースラインが安定しません。
午後中流していたのですが、ずーーーーーーっと下がって(という言い方でいいのかな?)いくのです。
蛇行したりするのではなく、とにかく下がり続けるのです。

移動相をメタノール・アセトニトリル・リン酸緩衝液のものから
メタノール・アセトニトリル・クエン酸緩衝液に変えたところでこの現象です。
セルに気泡が入ってるのかなー、とも思いますが昨日までちゃんとラインは安定していて、
カラムも変えてないし、一応脱気装置もついてるし・・・。

いったい何が原因なのでしょうか?
ちなみに測定物質は安息香酸です。

ちょっとでもヒントになることがあれば、ぜひぜひご教授ください。

Aベストアンサー

>>溶離液を頻繁に変えての系内洗浄は必ずカラムを外した上で行ってください。
>えっ、そ、そうなんですね・・・。(^^;)
>すいません、知らないことだらけで・・・。

カラムや溶離液の種類によって差異はありますが、頻繁に溶離液や圧を変更するとカラムの寿命が短くなります。カラム内の溶離液を交換する際は流量(圧)を下げ、時間をかけて穏やかにやるのが基本です。

rei00さんもおっしゃるように水で充分に洗浄したほうがよいでしょう。いきなりメタノールを通すと無機塩が析出してしまう可能性も生じてきますから。水で洗浄後、水/メタノール混合溶液→メタノール→水/メタノール混合→水、最後に使用する緩衝液といった順番で流せばいいように思います。有機物が付着している可能性があるのならば、メタノール洗浄後にアセトニトリルや場合によっては2-プロパノールで洗浄するのもいいかもしれません。


rei00さん、こんにちは。
>>溶離液を流しっぱなしにしておくと自然に問題が解決
>>することもよくあります(答えになっていないけど)。
>これは溶離液を流しっぱなしにした事で,系内の溶離液交換が完了した結果だと思いますが。いかがでしょうか。

そうですね。私が体験したトラブルの原因は、ほぼ100 %これによるものと考えています。

>>溶離液を頻繁に変えての系内洗浄は必ずカラムを外した上で行ってください。
>えっ、そ、そうなんですね・・・。(^^;)
>すいません、知らないことだらけで・・・。

カラムや溶離液の種類によって差異はありますが、頻繁に溶離液や圧を変更するとカラムの寿命が短くなります。カラム内の溶離液を交換する際は流量(圧)を下げ、時間をかけて穏やかにやるのが基本です。

rei00さんもおっしゃるように水で充分に洗浄したほうがよいでしょう。いきなりメタノールを通すと無機塩が析出してしまう可能性も...続きを読む

QHPLCでの内部標準とは

HPLCでの分析初心者です。
サンプル抽出時に、内部標準を加えることによって何が変わるのですか?基礎的なことだと思うのですが、難しくてよくわかりません。すみませんが、わかりやすく教えてください。

Aベストアンサー

Text 形式しか使えないので、ちょっと書きにくいんですが、その点は堪忍してください。

まず Recovery Rate (回収率) から説明したほうが、わかりやすいと思うのでそちらから。また一般論にすると、却ってややこしくなるかもしれないので、具体的な数値を使います。ご自分で一般化してください。

Matrix: Plasma 1 mL を使う
Analyte: Ci mg/mL
I.S.: S mg を 1 mL の Matrix に加える。

ここで、検量線は、0 から始まり、数 Points の濃度にしますね。これを処理して、最終的に HPLC に Load するために調製した溶液 (processed sample) を 200 microL にするとします。

I.S. が、100% 回収できたとすれば、processed sample 中の絶対量は、S mg/ 200 microL = 5S mg/mL になりますね。このうち 20 microL を HPLC に Load するとすれば、I.S. は、0.5S mg 入ることになります。これに対応する Response (Ri) が、観察される筈です。

実際には、抽出過程でのばらつきがあるため、観察される Response は、Sample により R'i のようにばらつくはずです。この R'i / Ri を絶対回収率 (Absolute Recovery) と言います。

同じように、検量線の場合は、加えた Ci は既知ですから、同じように Absolute Recovery を求めることができます。

次に、各 Sample 内での、Analyte と I.S. の関係を考えます。Matrix 中には
 Analyte Ci
 I.S. S
入っていますね。この両者の、抽出などの過程で生じる Absolute Recovery が、一定値 (多少のばらつきはありです) a だったとすれば、processed sample 中には、
 Analyte aCi
 I.S. aS
となるので、量は変化しますが、Analyte / I.S. の比は、一定になります。そこで、上げられた例のように、aS に由来する Response のばらつきは a に依存するので、Response がばらばらになることはありえます。ここで、Analyte の Absolute Recovery が、常に I.S. のそれに等しいのであれば、Analyte の Response も aCi になるので、Analyte / I.S. は、もともとの Matrix 中の比と同じになるので、検量線が、きれいに引けることになります。

これがまさに内標準法を採用する一つの目的です。検量線は、添加した濃度 (Concentration added) に対し、HPLC で得られる Analyte と Internal Standard の比 (Ratio of onserved Value) を回帰して、求めます。

これとは別に、絶対検量線法というのもあって、これは Analyte の Response そのものを回帰します。挙げられた例をこの方法で回帰したときには、ろくな検量線にはなりえませんね。これは Sample ごとの、Absolute Recovery のばらつきが大きいのです。このようなときにも、同じような Recovery を示す I.S. を用いることで、補正しているのです。


さて、もうひとつの方というのは、ここまでの話でお分かりのように、Analyte / I.S. が一定である、ことをまず証明、
 具体的にはある狭い範囲での直線性を確認します。
した後、単独の試料に一定量の I.S. を加え、分析。Response の比から、濃度を出してしまうものです。これは、単なる溶液になっているなど、Matrix が単純な場合用いる方法です。予想値が高い場合は、希釈する程度の操作で済むときに使います。実際の使用例は、動物に薬物を投与するときの溶液 (正式な用語は、被験物質調製混合物) の濃度検定 (きちんとした濃度でなければ投与量が計算できませんから)、被験物質調製混合物中の被験物質の安定性 (調製した後一定条件下で保存している間に壊れないかどうか) を調べるときに用いています。No. 2 が言われているのは、これに相当します。

参考に挙げたのは、FDA の正式 Document で英語ですが、実際にどういう目的で用い、どういう処理をするか、判定基準も含めて、きちんと記載しています。可能であれば、一度読んでみてください。検量線の処理方法などは、世界的に authorize されているのはこの文書だけです。

参考URL:http://www.fda.gov/cder/guidance/4252fnl.htm

Text 形式しか使えないので、ちょっと書きにくいんですが、その点は堪忍してください。

まず Recovery Rate (回収率) から説明したほうが、わかりやすいと思うのでそちらから。また一般論にすると、却ってややこしくなるかもしれないので、具体的な数値を使います。ご自分で一般化してください。

Matrix: Plasma 1 mL を使う
Analyte: Ci mg/mL
I.S.: S mg を 1 mL の Matrix に加える。

ここで、検量線は、0 から始まり、数 Points の濃度にしますね。これを処理して、最終的に HPLC に Load するため...続きを読む


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