63bpのdsDNAをssDNAとして精製しました。
PerfectMatchとNCの2種類の63merのオリゴDNAに対して、ハイブリダイゼーションを行い、dsDNAの形成するorしないを確認したいと思っています。
確認の前段階として、2つのDNAをハイブリさせなければなりません。
ハイブリダイゼーションの温度はTmよりも5~20度低い温度で行うと聞きましたが、
ハイブリダイゼーションのバッファーはどうしたらいいのでしょうか?
50%Formamide,10mMリン酸バッファーpH7.0や100mM KCl,100mM Tris-HClpH7.4,2mM MgCl2などの例がありましたが、
FormamideやMaCl2を入れる理由がわかりません。
2つの質問になりますが、ご存知の方教えていただけると幸いです。
No.2ベストアンサー
- 回答日時:
Formamideを使うと、低い温度でハイブリができるので、目的に応じて、ターゲットを高温にさらしたくないとき、あるいは全くの実験者の好みで、DNA/RNA ブロットハイブリやin situ ハイブリのとき使われます。
特別の考えがないのであれば、formamideなしの系でいいのではないでしょうか。
おそらく、
>50%Formamide,10mMリン酸バッファーpH7.0
は、塩濃度が低く50% formamideを含むので、かなりアニールしにくいとみました。
>100mM KCl,100mM Tris-HClpH7.4,2mM MgCl2
これは、ほとんどTaq polのバッファーですね。
理論式で計算するとTm75℃前後になるでしょうか。
Molecular CloningにはオリゴDNAの鎖長、GC%、塩濃度からTmを計算する理論式も出ていますから、塩濃度と温度が妥当な条件を選んでみたらいいと思います。
この回答への補足
特に低温条件を必要としないので、Formamideなしの系で検討したいと思います。
確かにPCRバッファーはアニールさせることを前提としているので、この系で行えば無難なのかもしれません。
>100mM KCl,100mM Tris-HClpH7.4,2mM MgCl2
>これは、ほとんどTaq polのバッファーですね。
>理論式で計算するとTm75℃前後になるでしょうか。
これはgeneticist12さんが塩濃度と63bpから計算したTmという意味でしょうか?
No.1
- 回答日時:
formamideはTmを下げる働きがあります。
1% formamideにつき0.6℃ Tmが下がるといわれています。また、formamideはハイブリの速度を遅くします。(Molecular Cloning参照)。たとえば、サザンブロットで5xSSCで68℃が適当であるところ、formamideを50%加えると、42℃が至適になります。
Mg++は、duplexを安定化します。PCRのときMgCl2の濃度を振ったりするのは、プライマーのアニール、ミスアニールの安定性をコントロールするためです。
その実験で、ハイブリさせるといっているのは、ブロットに対してでしょうか、それとも溶液中ででしょうか。溶液中でduplexを作るときは、formamideを加えるのはあまり一般的ではないように思いますが。
この回答への補足
回答ありがとうございます!
formamideには、そのような効果があるのですか!
Molecular Cloningを参照してみます。
この実験では溶液中でハイブリさせようと考えています。
Tmが特別高くない限りはFormamideを加える必要はないのでしょうか?
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