プロが教える店舗&オフィスのセキュリティ対策術

1細胞における遺伝子のコピー数ってどうやったらわかるのでしょうか?たとえばハウスキーピング遺伝子とかでもよいのですが。細胞の種類によってももちろん違ってくると思うし。ご存知の方はぜひ教えていただければと思います。

教えて!goo グレード

A 回答 (3件)

まず、一細胞からRNAをとって分析するのは、PCRが使える現在となっては不可能ではないですが困難です。

十分量の細胞や組織を使って、細胞数を計測したりいろいろな方法で推測したりして、一細胞あたりのRNA量に換算するのが普通でしょう。

特定のターゲットmRNAのコピー数を求める方法としては、
1. RNase A protection assay
古典的な方法ですが、おそらく最も定量性がよいです。
in vitro transcriptionなどで、ターゲットRNAの一部に相補な放射性ラベルRNAプローブを作ります。放射性ヌクレオチドの取り込み率から収量が求められますし、一般的な定量法法で収量を求めても良いですが、収量(重量)がわかれば設計したプローブの分子量で除してモル数(これにアボガドロ数をかければコピー数になる)が求められます。モルあたりの比活性も算出できます。

サンプルRNAに過剰量のプローブを加え適当な条件でインキュベートすると、ほぼ100%のターゲットに一分子あたり一分子のプローブがハイブリします。その後、一本鎖RNAを特異的に分解するRNase Aで消化すると、ハイブリしなかった過剰のプローブは分解され、ハイブリしたプローブだけが残ります。分解されなかったプローブの放射活性からハイブリしたプローブのモル数(=ターゲットRNAのモル数)が求められます。

2. 定量PCR
No. 1さんが書いている通りですが、補足すると、
ターゲットRNA(から逆転写されたcDNA)に対するのと同じプライマーで同程度の増幅をする(つまり長さや配列が極端に変わらない)濃度既知のテンプレートをコンペティターとして加えてPCRをかけます。等量のサンプルに対してコンペティター量を振って、ターゲット由来のPCR産物とコンペティター由来のPCR産物の量が等しくなるポイントを検量線から求めます。そのポイントのコンペティターのコピー数ががターゲットRNAのコピー数ということになります。

ただし、ターゲットRNA量を正確に測定するためには、コンペティターはPCRの段階でプラスミドなどのDNAを加えるのではなく、in vitro transriptionなどで合成したRNAを逆転写の段階から加えるべきです。 なぜなら、逆転写反応はRNAサンプルに対して100%の効率ではなく、しかも反応ごとに効率が振れるものだからです(一般的に10~50%くらいの効率)。
    • good
    • 0
この回答へのお礼

とても丁寧に回答していただきましてありがとうございます。参考にさせていただきます。

お礼日時:2006/11/27 12:06

 すみません。

肝心なところが抜けていました。

5.出たコピー数をテンプレート量と細胞数で計算して、細胞1個あたりのmRNA数を算出する
    • good
    • 0

 そういう実験はしたことがないので、単に私の知っていることと持っている技術を組み合わせて「私ならこうする」程度のことしか書けませんが。



1.細胞数をカウントする
  計算盤かパーティクルカウンターか何かで、とにかく単位容積あたりの細胞数を出します。

2.その細胞の単位量から懸濁液を造り、遠心して細胞ペレットを得る

3.そのペレットよりRNAを抽出する

4.目的遺伝子のプライマーを使って、コンペティティブPCRかリアルタイムPCRを実施して、遺伝子のコピー数を出す

 求める精度にもよると思うのですが、これでいけませんかね?
 標準プラスミドを作らなきゃならないのが手間ですが。
    • good
    • 0
この回答へのお礼

回答ありがとうございます。やはり多数の細胞から平均をとるという形なのですね。ありがとうございます。

お礼日時:2006/11/27 12:02

お探しのQ&Aが見つからない時は、教えて!gooで質問しましょう!


人気Q&Aランキング