ここから質問投稿すると、最大4000ポイント当たる!!!! >>

動物の組織切片標本を作ろうと思っています.自動包埋機がなく,パラフィン包埋(エタノールで脱水→キシレン→パラフィン)を1日でやるのはすこしきびしいので,どこかの工程で一夜置いておこうと思うのですが,どこが一番よいでしょうか?また,ここであまり長く置くとよくない,というところがありますか?

よろしくお願いします.

このQ&Aに関連する最新のQ&A

A 回答 (3件)

最初に70%程度の低濃度アルコールで一晩置くと、後の処理がスムーズで、なおかつ組織の収縮も少ないです。

アルコール濃度が高くなると、その分組織の収縮もきつくなります。ですが、あまり組織片が小さすぎると、かえって収縮がきつく起こる可能性もありますので、ゆっくりと時間を掛ける場合は、気をつけた方が良いでしょう。

パラフィン層で長時間置くのは避けるべきです。熱が掛かっている分、やはり組織へのダメージは強くなるわけですから。キシレンまで済んでしまえば、浸透器があるのでしたら、そこで1時間ずつ3層パラフィンを置けばいいでしょう。

組織標本の作製は、どの組織をターゲットとするかでも違ってきます。脂質の多い脳などでは、アルコール処理を長めにして、十分に脱脂効果を狙って包埋していく工程を取ったりします。
    • good
    • 0
この回答へのお礼

回答ありがとうございます。
70%アルコールで一晩置き、次の朝から始める方法で、その日のうちにすませられそうです。

お礼日時:2002/05/20 20:48

私は90~100%程度のエタノールで止めるのを推奨します。



組織の収縮はキシロールで著しく進行することが判っていますし、パラフィンで
長時間置くと無用の熱を加えることになり、さらに収縮した揚げ句とても固くな
ります。そこらへんの話は黄色い表紙の「病理技術マニュアル」に載ってたと思
いますので図書館で探してください。

ちなみにラットやマウスの類でしたら、ウチでは自動包埋装置ですが12時間の
プロトコールで回してます。朝からやれば夜には仕上がる計算ですね。固くなり
すぎなくてイイカンジですよ。
    • good
    • 1
この回答へのお礼

アドバイスありがとうございます。
100%エタノールの辺が時間的にまん中あたりなのでここで置いたら楽かな、と思います。なるべくなら1日ですますような方法も考えてみようと思います。

お礼日時:2002/05/20 20:55

こんにちは。


この中で一番よろしくないとするとエタノールではないかと思います。
止めるとすれば、脱アルコールの最期の方のキシレンか、パラフィン透徹の最初の所がいいのではないでしょうか。
    • good
    • 1
この回答へのお礼

回答ありがとうございます。
No.2,3の方はアルコールの方がいいと書かれており、そちらに気持がかたむいています。

お礼日時:2002/05/20 21:02

このQ&Aに関連する人気のQ&A

お探しのQ&Aが見つからない時は、教えて!gooで質問しましょう!

このQ&Aを見た人が検索しているワード

このQ&Aと関連する良く見られている質問

Qパラフィン切片について

こんにちは、いつもお世話になってます(^_^)

皮下組織を含む皮膚組織を包埋した
パラフィンブロックを薄切して
3μm厚のパラフィン切片を作製しています。

薄切するところまではいいのですが…、
悩みは次の二つです。
(1)伸展版にスライドグラスを置いて
 30分くらい経って切片を見てみると
 組織のなかに(スライドグラスと切片の間に)
 泡ぶくというか水泡のような盛りあがり
 ができている。

(2)脂肪組織を多く含む大きめの切片は
 伸展版にのせておくと花開くように
 分解して組織がくずれてしまう。

原形を保ったままきちんとスライドグラスに
貼り付けたいです…。
改善できるよい方法をお知りの方、ご教授願います。
ちなみに、
使っているスライドグラスはアルブミンスライドです。
伸展版にのせたあとは十分に水分をろ紙で除いています。
伸展版の温度は45~48度の設定です。
油分が残らないように手はしっかり洗ってから行っています。

Aベストアンサー

一番考えられる要因は、伸展台の温度が高いことです。温度設定は教科書通りでも、実際の温度が表示温度よりも高い場合があります。
脂肪組織が解離しやすいのもこれが特に大きな要因になります。
乾くのに時間が掛かっても仕方がないと思い、伸展台の温度をもう5℃ほど低めに設定されてみてはいかがでしょうか?

またもう一つ考えられる要因は、切片とスライドグラスの間に水分が残っていることです。切片をスライドグラスに載せた後は、スライドグラスを傾け、しっかりと濾紙に水分を吸い取らせる必要があります。
私の場合は、伸展台にキムタオル(薄い1枚にした物)を伸展台の上に敷き、切片をスライドグラスに載せた後、スライドグラスを傾けて、なかなか切片の下の水分が切れない場合は、切片の角を少し破って、そこに濾紙を当てて吸い出してました。こうすると、水泡のような物が出にくくなります。

さらに、薄切して切片をスライドグラスに取る前に、水ではなくお湯を使われていますか?この場合、お湯が高いと、当然脂肪組織は解離しやすくなりますので、温度には注意する必要があります。人肌より少し温かい位が適温です。水よりもお湯の方が伸びが良いので、お湯を使うこと自体は悪くないと思います。
さらに、私は脳組織を主に薄切していたのですが、その際には、1%酢酸水を温めたものに切片を浮かせて伸ばし、スライドグラスにすくってました。こうすると、きれいにしわもなく伸び、他の組織切片を作製する際も、多少臭いですが、きれいに仕上がるのでこの方法で行ってました。

一度お試しあれ…。

一番考えられる要因は、伸展台の温度が高いことです。温度設定は教科書通りでも、実際の温度が表示温度よりも高い場合があります。
脂肪組織が解離しやすいのもこれが特に大きな要因になります。
乾くのに時間が掛かっても仕方がないと思い、伸展台の温度をもう5℃ほど低めに設定されてみてはいかがでしょうか?

またもう一つ考えられる要因は、切片とスライドグラスの間に水分が残っていることです。切片をスライドグラスに載せた後は、スライドグラスを傾け、しっかりと濾紙に水分を吸い取らせる必要があり...続きを読む

Q組織の固定処理から包埋に移る際に

パラフィン処理をすると思うんですが、流動パラフィン(和光社製)
で行えばよろしいのでしょうか?

はじめて組織切片をつくるため色々な本を参考にしてはいるのですが、
パラフィンのことは特に何も書いていないので良くわからないので質問させていただきました。

回答宜しくお願いします。

なおプロトコルは東京大学ラボマニュアルー核内情報研究分野を参考にしています。

Aベストアンサー

パラフィンは60℃の恒温器であらかじめ溶かしておきます。恒温器は汚れますから、専用のものにします。サイズは組織の量にもよりますが、最低でも100mLビーカーが3つ以上入るサイズにしましょう。大きい方が開けたときの温度低下が少ないので良いです。温度が下がると瞬く間にパラフィンが硬化してしまいます。パラフィンの種類は組織用のもので、55℃位の低融点ものから60℃以上の高融点のものまであります。低融点のものは大きな組織に有効ですが、高融点のものは切片を切るとき硬めなので切りやすいです。汎用は58-60℃の融点のものでしょう。

5mm角以下の組織であれば、70,80,90,95,100%エタノールを1-3時間ずつ室温で浸漬していきます。組織によっては浸透しにくいものもありますので、これは経験になりますが、極端に長くならなければ大丈夫ですので、不安なら多めに浸漬すると良いでしょう。100%エタノールは3回ほど通し、完全に水分を除去します。その後キシレンを1-1.5時間、計3回移し、60℃のパラフィンに浸漬します。キシレンとパラフィンの間にXyl:para=1:1に浸漬するとパラフィンが浸透しにくい組織に有効です。この時に流動パラフィンを使うこともできますが、Xyl/paraで十分です(しなくても良いです)。60℃のまま、恒温器の中で30-60分ずつ計3回ビーカーの組織を移していきます。
包埋する際には、予め温めた包埋皿(ステンレス製のものがありますが、アルミホイルで型を作った方が安い)に60℃のパラフィンを注ぎ、組織を沈めます(切る方向が底面からになりますので方向性を確認して)。軍手をしないと熱いです。ピンセットはアルコールランプやガスバーナーで熱しながら組織を扱います。ホットプレート(低温60℃程度にできるもの)があると余裕ができるので楽です。自然に室温に放置しておけば固まります。台木などに熱したスパーテルで貼り付けてミクロトームで切ります。

とにかく、周辺がパラフィンで汚れますので、器具はパラフィン専用とし、実験台にも新聞紙を敷きましょう。もし汚れたらキシレンを浸み込ませたペーパータオルで拭きます(臭いので換気して)。

パラフィンは60℃の恒温器であらかじめ溶かしておきます。恒温器は汚れますから、専用のものにします。サイズは組織の量にもよりますが、最低でも100mLビーカーが3つ以上入るサイズにしましょう。大きい方が開けたときの温度低下が少ないので良いです。温度が下がると瞬く間にパラフィンが硬化してしまいます。パラフィンの種類は組織用のもので、55℃位の低融点ものから60℃以上の高融点のものまであります。低融点のものは大きな組織に有効ですが、高融点のものは切片を切るとき硬めなので切りやすいです。汎用は58...続きを読む

Q染色についての疑問なのですが、誰か教えて下さい。

病理学実習で行った最も有名で、1番popularなHE染色についてなのですが…
(1)今回実習で行ったのは、カラッチのヘマトキシリンだったのですが、他には、どんな種類が存在しますか?
(2)カラッチのヘマトキシリンを作ったときに、いろいろな物を加えました。それで、ナノですが、ヘマトキシリン液についての原理を知れば、入れた物質の役割が分かるのではないかと考えました。そこで、質問です!!ヘマトキシリン液の原理って、何ですか?
(3)染色には、退行性と進行性があり、退行性の染色液には、”分別”と言う操作が、必要って、文献に書いてあったのですが…分別には、どんな種類の薬品を使うのですか? 実習では、0.25%塩酸を用いました。
(4)試薬が、良ければ、色出しの操作は、不要みたいなのですが、色出しって、何なのですか?色出しには、どんな試薬が、使われているのですか?

だれでも良いので、こんな馬鹿な私に教えて下さい。

Aベストアンサー

実習の時に質問すりゃぁいいのに…ま、病理医にはわからんか。

私の場合普段はマイヤーの処方を薄い切片用にアレンジした「ダブ
ルマイヤー」を常用していますが、必要ならカラッチやギルも調整
します。ハリスは水銀を使うからパス。ワイゲルトの鉄ヘマトキシ
レンはHE染色用ではありません。

処方の基本は、「色素」+「酸化剤」+「媒染剤」です。酸化剤には
ヨウ素酸ナトリウムを常用します。これで無色のヘマトキシレンが
ヘマティン色素になります。媒染剤は金属イオンを添加して色ラッ
クを形成させ組織との結合を強くするもので、ミョウバンを使うと
青紫になります。ここで鉄を使うと茶褐色っぽい色になりますね。
最後に安定剤として抱水クロラールやグリセリンを混ぜて完了。色
ラックが正に帯電しているため、負に帯電するリン酸基やカルボキ
シル基と結合しやすいわけです。

分別ですが、上記の理屈で染まるからにはpHの影響ってモノを受け
るわけで、pHが4くらいだと結構なにもかも染まってくるんです。こ
れを、染めた後で塩酸アルコールなどでpHを下げて、リン酸基のと
ころだけ残してカルボキシル基のところを脱色してやるのが「分
別」という作業です。全体を染めてから要らないところを抜くから
「退行性染色」。逆に最初っから酸を加えてpH2とかの染色液を作
り、リン酸基リッチのところしか染まらないようにしたのが「進行
性染色」。カラッチが退行性染色の代表で、マイヤーが進行性染色
の代表です。

色出しってのは、ヘマトキシレンで染色した後でしばらく流水で洗
うステップですが、これはpHを上げています。すると水素イオンが
色ラックに干渉し難くなり、赤褐色から安定した青紫色になって、
褪色もしなくなります。

以上、藍染めと全く同じだよっていう話でした。

実習の時に質問すりゃぁいいのに…ま、病理医にはわからんか。

私の場合普段はマイヤーの処方を薄い切片用にアレンジした「ダブ
ルマイヤー」を常用していますが、必要ならカラッチやギルも調整
します。ハリスは水銀を使うからパス。ワイゲルトの鉄ヘマトキシ
レンはHE染色用ではありません。

処方の基本は、「色素」+「酸化剤」+「媒染剤」です。酸化剤には
ヨウ素酸ナトリウムを常用します。これで無色のヘマトキシレンが
ヘマティン色素になります。媒染剤は金属イオンを添加して色ラッ
クを形成さ...続きを読む

Q凍結切片に泡

マウスの胚(E11.5)の凍結切片の作製を行なっているのですが、顕微鏡で観察すると組織のところに泡が入っていて泡のある部分の組織が崩れたり、抜けてしまっています。包埋の条件は解剖後、4%PFAで4℃45分固定後15%, 30% シュークロース/PBSで置換した後、コンパウンドで包埋してドライアイス上で凍結しています。クリオスタットの庫内の温度は-20℃で切片の厚さは10μmです。包埋する時にコンパウンドには泡が入っておりません。また組織の周辺に泡は見られず組織の中にみられます。解決方法で考えられることがございましたら、よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

kudann2001さんやmilk_teaさん、両者のおっしゃる現象のどちらかが生じていると思われます。どちらの現象が生じているのか知りたいのであれば、全ての切片を観察してみて下さい。もし必ずしも組織内でないのなら、kudann2001さんのおっしゃる現象が生じているのでは。もしその場合、今後こうした現象の発生を最小限に抑えたいと言うのであれば...下記の製品を使用してください。
しかし、4%PFA, 45分って、、、短くないですか?浸透を考えたら、ハラに穴を空けるとかした方が良い様な気がしますね。

参考URL:http://www.finetec.co.jp/products/others/04.html

Qホルマリン

『ホルマリン』は『中性ホルマリン』とは別物ですか?
中性ホルマリンが必要なのですが、今手元にあるものに『ホルマリン』と表示されています。

Aベストアンサー

1点だけご確認ください.
10%ホルマリン溶液はリン酸bufferで調製しますが,そのリン酸bufferを蒸留水で調製したものと,生食で調製したもの(PBS)と使い分ける場合があります.

指定がありますか?
なければ蒸留水の方でよろしいかと思います.

ウチの会社のレシピは以下のようになっています(10L調製).
1)リン酸二水素カリウム(KH2PO4)…25g
2)リン酸水素二ナトリウム12水和物(Na2HPO4・12H2O)…170g
3)ホルマリン原液…1000mL

1),2)を蒸留水(水道水でも可)にきちんと溶解させて5~7L(だいたいでOKです)とする.
その後,3)を加える.
最後に蒸留水(水道水でも可)を加えて全量を10Lとする.

余談ですが,ウチでは他の固定液との混合をさけるために,1%エオジン水溶液を数滴たらしてわずかに赤くしています.固定の浸透力に対するエオジンの影響はほとんどありません.

1),2)が上記と水和物の数などが異なる場合,水以外のmol数が大体同じであればOKですから,計算して求めてみてください.

1点だけご確認ください.
10%ホルマリン溶液はリン酸bufferで調製しますが,そのリン酸bufferを蒸留水で調製したものと,生食で調製したもの(PBS)と使い分ける場合があります.

指定がありますか?
なければ蒸留水の方でよろしいかと思います.

ウチの会社のレシピは以下のようになっています(10L調製).
1)リン酸二水素カリウム(KH2PO4)…25g
2)リン酸水素二ナトリウム12水和物(Na2HPO4・12H2O)…170g
3)ホルマリン原液…1000mL

1),2)を蒸留水(水道水でも可)にきちんと溶解させて5~7L...続きを読む

Q凍結切片の作成方法

GFP(緑色蛍光たんぱく質)の発現を観察するために、凍結切片を造りたいのですが、以前行ったときにひどく収縮してしまいました。

多少の変化は仕方ないと思っていますが、改善策はないでしょうか?

以前の作成方法は、組織片1cm3くらいを無処理で、直接液体窒素に投入し、その後-80℃に保存し、-20℃のクライオスタット内で金属製の台に包埋剤で固定し、少し厚めに切り、スライドグラスに載せ、室温で乾燥させ、そのまま蛍光顕微鏡で観察しました。

固定をするとGFPが失活してしまうと思うので、固定はできないと思います。インターネットで調べてみると、シュークロースで処理して凍結するとか、スライドグラス上ですばやく乾燥させるとかで改善できるのかな???などと想像しているのですが・・・いかがでしょうか?

アドバイスお願いします。

Aベストアンサー

凍結過程で試料が変形or収縮してしまうのを防ぐには30%シュークロースに漬けるといいです。
ただ、いきなり30%ではうまく浸透しないかもしれないので、
10,20,30%と段階的にした方が良いかもしれません。

乾燥過程で試料が変形or収縮してしまうのを防ぐのは難しいですが、
PBS:グリセリン=1:1の溶液でカバーガラスに封入しておく方法がお勧めです。(要は乾燥させない)
スライドグラスの上に載った試料にPBS/グリセリンを滴下し、
カバーガラスを載せてマニキュアのトップコートで四辺をカバーし、乾燥を防ぎます。


あと、砂糖漬けにした試料を蟻が持っていく事が多いので注意してください。

Q凍結切片の脱水について

昆虫の脳の凍結切片を作成しているのですが、きった切片を顕微鏡で観察すると組織が収縮してしまいます。
今のプロトコルは
脳の解剖後、4%PFAで4℃O/N、固定後10%スクロース/PBS 8h、20%スクロース/PBS O/N、30%スクロース/PBS 8hで脱水した後、コンパウンドで包埋して液体窒素で凍結しています。
原因は脱水が不十分かと思うのですが、脳はスクロース溶液中で沈んでいることは確認しています。
逆に脱水が長すぎるのでしょうか?
うまくいく方法があったらぜひ教えてください。
お願いします。

Aベストアンサー

昆虫の脳は切ったことはありませんが,ゼノパスやマウスの下垂体は切ったことがあります。マウスの胎児の脳は水分が多く切りにくいものでしたが,脱水に十分な時間を取ったように記憶しています。実験プロトコルは全く記憶にないのですが(ショ糖溶液かさえも記憶にない?),脱水の一番目の溶液も一度交換し,二番目の溶液は何回も溶液を交換しながら何日間かかけて徐々に脱水したように記憶しています。あまりに昔のことで記憶が曖昧で信頼性のない情報ですが何かの参考になりましたなら…

Q無水エタノールの精製方法について

含水エタノールから無水エタノールを調整する方法は、幾つかあると思うのですが、”化学反応により水を除去する方法”と言われたら、ベンゼンとの共沸脱水方法で良いのでしょうか??

あと、調整した無水エタノールが、無水であることを確認する方法はあるのでしょうか。

ご存知の方、是非ともよろしくお願いします。

Aベストアンサー

よく使われる方法が、金属ナトリウムをプレスしてナトリウムワイヤーを作り、それを共沸や無水酸化カルシウムで脱水したエタノールに加え、生成したナトリウムエトキシドとともに蒸留する方法です。
有機化学について質問させていただきます。 - 教えて!goo ( http://oshiete1.goo.ne.jp/kotaeru.php3?q=5553491 )
にも書いた。
具体的には、
エチルエステルと水、ナトリウムエトキシドの不可逆反応を利用する方法で

 RCOOC2H5 + C2H5ONa + H2O → RCOONa + 2C2H5OH

 Rはコハク酸やフタル酸のように項沸点のものを使う。

 詳しくは文献をチェックすること。古いです・・古典的手法ですが、あまりにもマイナーなので・・・
E.L.Smith J.chem.Soc., 1288(1927)
R.H.Manske, J.Am.Chem. Soc., 53,1106(1931)

学生時代は、日々、原料として必要な無水アルコールを調整していましたね。

Q包埋皿からスムーズにパラフィンブロックを外す方法。

包埋皿からスムーズにパラフィンブロックを外す方法。
今までは、パラフィン包埋をするのに陶器?の包埋皿にグリセリンを塗って使用していたのですが、今回包埋カセットを利用できるようにティシューテックのステンレスの包埋皿を購入しました。
しかし、この包埋皿からうまくブロックを取り出すことができません。ブロックの取り出しのコツをご教授いただければと思い質問させていただきました。
初歩的なことで申し訳ございませんが、よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

> 周辺温度を-5℃程度に
> できれば特別なことをしなくても外れる

と思いますよ。大昔、台木から外して包埋し直すときに、冷凍庫に
入れとくだけでみんなとれちゃいましたから。

大量に薄切してみれば、急速に均一に冷却されたパラフィンの切り
やすさは実感出来るはずです。翌週もう1ダース追加で薄切するは
めになれば、ティシューテックに感謝することになります。この道
四半世紀になりますが、スライドグラスを特注するような大型標本
でない限り、ティシューテックを使わないって選択肢は勘弁してほ
しいですね。

Qモレキュラーシーブスを用いて100%のエタノールを作りたいと思っていま

モレキュラーシーブスを用いて100%のエタノールを作りたいと思っています。
ウィキペディアを参考にすると、「市販のモレキュラーシーブスを150g、100mlの溶媒に投入」と記載されていましたが、モレキュラーシーブスの容量はこのぐらいでよろしいのでしょうか?
私的には150gは多いような気がします・・・
モレキュラーシーブスの投入量を教えていただけないでしょうか?

Aベストアンサー

100%のどこまでの数字がいるのかわかりませんが、
(本当に100.0%なのか99.9%でも良いのか)
とりあえず、モレキュラーシーブの量の目安を上げておきます。


モレキュラーシーブの乾燥能力は最大20%なので、
99.5%のエタノール1Lの場合、50gのモレキュラーシーブが必要です。
これに安全を見て、若干多めに入れれば良いのでは?
モレキュラーシーブは3Aをお使いください。
http://www.nacalai.co.jp/information/trivia2/01.html

もっと100.0%に近い物が必要なら#1さんのおっしゃるとおり、
マグネシウムエトキシド法でやるのでは無いでしょうか。


人気Q&Aランキング