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レトロウイルスベクターを使って遺伝子導入を行おうか検討しています。
現在、原理を勉強しているところですが、理解できないことがあるので質問させていただきます。
レトロウイルスベクターを脂質か何かで導入したパッケージング細胞はウイルスを出芽しますよね。
その出芽できるウイルスの最大数は理論上、

ウイルス出芽数=導入されたベクター数

と考えてよいのでしょうか?

そうなると、レトロウイルスベクターを導入したパッケージング細胞を培養し続けると、いつかはレトロウイルスを出芽しなくなるのでしょうか?
となるとベクターを導入したパッケージング細胞の冷凍保存はあまり意味のないものと考えてよろしいのでしょうか?
申し訳ありませんが、どなたか教えていただけないでしょうか。
宜しくお願いいたします。

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A 回答 (1件)

哺乳類細胞で作るシュードレトロウイルスを産生するベクターの場合、


入れたベクターから転写、翻訳されてウイルスが作られるので、
ベクターが抜け落ちたり、ゲノムにはいってサイレン寝具を受けるまではウイルスが作られます。

この場合には、出芽と言う用語は使われないと思いますが、
何か別のシステムなのでしょうか。
どのベクターとパッケージングセルを使ったシステムでしょうか?
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QDNAとゲノムDNAの違い

DNAとゲノムDNAの違いを教えてください。
遺伝子とDNAの違いはわかるのですが、上記の2つについてはわかりません。
よろしくお願いします。

Aベストアンサー

ゲノム
http://ja.wikipedia.org/wiki/%E3%82%B2%E3%83%8E%E3%83%A0

DNA
http://ja.wikipedia.org/wiki/DNA
DNAは化学的な物質名で人口に合成した化学物質でも、その化学的構造を持っていればDNAといいます。

ゲノムDNAの定義はよく分かりませんが、真核生物などはミトコンドリアなどにもDNAがあり、それと区別してゲノムDNAといえるかもしれません。また、ウイルスが感染しいて、染色体以外にDNAが存在する時、両者を区別するのにそういう表現ができると思います。

Qウェスタンブロットのサンプルのinputの意味

今呼んでいる分子生物学系の論文なのですが、ウェスタンブロットの結果のFig中に
C:control、IP:immunoprecipitationの他にもう一つ、inputと書いてあるサンプルがあります。これは一体どのような意味を持つサンプルなのでしょうか。
微妙に専門外なのでホントに基礎的なことだったらすみません。
詳しい方解答よろしくお願いします。

Aベストアンサー

正確な表現ではないですが数式で書くと
Input = IP+ flow through となります。
入れた物 = 抗体についた物+つかなかった物
ただ全量泳動することはできませんので、一般にNo.1のかたが書かれたように1% Inputとか10% inputとして泳動します。
抗体反応中の分解や容器等への付着、洗浄中の脱落および吸着の定量性を示したい場合にはflow throughを示しますが、一般にIPのデーターでは、どのようなサンプルを使用し、抗体でどの程度濃縮されたかを示すにとどめますので、ご質問の3つのレーンとなります。inputには、使用したサンプルにどのくらいの量の目的の因子が入っていたかを示す意義が主ですが、論文中のどこにも%を書いていないものもあります。そのときには、単にそのバンドの高さを示すのみの意味になってしまいます。
メンブレン全体をfigureにする場合には、inputのレーンが抗体の特異性などを示すために使うこともあります。
ご参考までに。

Qrpmをgに変換する方法(遠心分離機)

rpmをgに変換するには回転半径が必要になるそうですが、
半径は機械のどこかに書いてありますか?
また変換計算方法を教えていただけませんか?

操作パネルではrpmで入力するようですが、
私のやりたい遠心操作は例えば『600×g』というような操作なので、
変換計算をしてrpmを求めなければいけないようです。

Aベストアンサー

円運動の加速度a[m/s^2]は、中心方向に
a = rω^2 [m/s^2]
となります。遠心力f[N]は物体の質量をm[kg]として、
f = mrω^2 [N] ・・・(1)
となります。
ここでω[rad/s]は角速度で、1秒間に回転する角度[rad]、r[m]は回転半径です。

1分間では60ω[rad]回転しますので、この値を1周の2πで割った値が[rpm](1分間あたりの回転数)の値となります。
A[rpm] = 60ω/2π
これを式変形して、
ω[rad/s] = 2πA/60
となります。

これを(1)へ代入して遠心力は
f = mr(2πA/60)^2 [N]

となり、この力を質量で割った値が加速度aになるので
a = f/m 
  = r(2πA/60)^2 [m/s^2]
  = r(2πA)^2 / 360 [m/s^2]

となります。これが、重力加速度g(=9.8[m/s^2])の何倍にあたるかをあらわしたものがN[G]ですので、
N = a/g
  = r(2πA)^2 / 360g
  = r(2πA)^2 / 3528 [G]
となります。

以上の式からわかるように、[rpm]を[G]に変換するためには回転半径r[m]が必要になります。単位がメートルですので(センチ、ミリではありません)注意してくださいね。

【計算例】

r=10[cm]、A=100[rpm]で計算すると、
N ≒ 10[G]

r=10[cm]、A=10000[rpm]で計算すると、
N ≒ 10万[G]


となります。

円運動の加速度a[m/s^2]は、中心方向に
a = rω^2 [m/s^2]
となります。遠心力f[N]は物体の質量をm[kg]として、
f = mrω^2 [N] ・・・(1)
となります。
ここでω[rad/s]は角速度で、1秒間に回転する角度[rad]、r[m]は回転半径です。

1分間では60ω[rad]回転しますので、この値を1周の2πで割った値が[rpm](1分間あたりの回転数)の値となります。
A[rpm] = 60ω/2π
これを式変形して、
ω[rad/s] = 2πA/60
となります。

これを(1)へ代入して遠心力は
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Qグリセロールストックについて?

学生時代、大腸菌をグリセロールストックすると保存状態が良く長期間保存できる?という事をを教わったような記憶があります。なぜ普通に凍結するより状態が良いのでしょうか?理由とグリセロールストックの操作方法を教えて下さい。又、大腸菌以外の微生物にも有効なのでしょうか?教えて下さい。お願いします

Aベストアンサー

細菌類ならなんでもできると思います。
細菌を培養した液を保存用の小さいチューブに移し、グリセロールを加えて冷凍し(液体窒素やドライアイスなどで急速冷凍するのが望ましい)、マイナス80℃のフリーザーで保存します。半永久的に保存できます。グリセロール濃度はものの本や各メーカーから提供される形によって15-50%と幅がありますが、濃度が低めのほうが再融解しにくく持ちが良いように感じます。
使用するときは、凍結したまま少量を削り取って培地にまきます。

ちなみに、生物学研究で用いられるモデル生物のひとつ、線虫もグリセロールストックします。

Qプラスミド精製の原理

大腸菌からプラスミドを取り出す(精製)の
原理を簡単にいうとどんな感じですか?

今はキアゲンのキットを使っているので
いまいち原理がつかめません。
塩化セシウム、ボイル法とかありますが、
教科書を読んでもいまいちピンきません。

簡単に教えていただけませんか。

Aベストアンサー

1.大腸菌のサスペンションにアルカリ溶液を入れる
(大腸菌の膜が壊れて、タンパクやDNAなどが出てくる。DNAはアルカリで変性して一本鎖になる)

2.酸で中和する
(変性したタンパクなどは析出、長いゲノムDNAは中和で二本鎖に戻ろうするが、長いので絡まって析出。プラスミドDNAは小さいので二本鎖に戻って溶液中に存在)

3.遠心分離して上澄みを回収
(タンパクや絡まったゲノムDNAなどは沈殿、上澄みにあるプラスミドDNAを回収)

4.昔は(10年前の記憶だと)、フェノール・クロロホルムで、残りのタンパク質・脂質などを除く。
(脂質はフェノール層へ、DNA・RNAは水層へ、タンパク質は中間層へ分離するので、水層を回収)

5.その後、イソプロパノールでDNA・RNAを沈殿させる。(イソプロパノールでDNAの水和水が取られて、DNAが不溶化して沈殿する)

6・RNA分解酵素でRNAを分解して、もう一度フェノール抽出をして、エタ沈(イソプロと同じ原理)して、その沈殿を回収するとプラスミドDNAが得られる。

キアゲンは、4のところで、カラムにかけると、DNAが樹脂に結合するので、bufferで不要なものを洗い流して、最後にpHを変えると、プラスミドDNAは溶出されてきます。キアゲンのホームページからマニュアルをダウンロードすれば、詳しく書いてありますよ。

1.大腸菌のサスペンションにアルカリ溶液を入れる
(大腸菌の膜が壊れて、タンパクやDNAなどが出てくる。DNAはアルカリで変性して一本鎖になる)

2.酸で中和する
(変性したタンパクなどは析出、長いゲノムDNAは中和で二本鎖に戻ろうするが、長いので絡まって析出。プラスミドDNAは小さいので二本鎖に戻って溶液中に存在)

3.遠心分離して上澄みを回収
(タンパクや絡まったゲノムDNAなどは沈殿、上澄みにあるプラスミドDNAを回収)

4.昔は(10年前の記憶だと)、フェノール・クロロホルム...続きを読む

Q細胞の増殖率が急に弱くなりました。

SIRC細胞の増殖をしているのですが
急に増殖率が半分以下くらいになってしまいました。
夏に細胞が全滅してしまい
よそ様から株わけしてもらってから全然細胞の増殖が悪い感じです。
培地の変化はありません。
培地はDMEMに10%FBS添加したものを使っています。
どうしたらいいのか
細胞学に詳しくないので基本的なこともわかりません。
どうかアドバイスお願いします。

Aベストアンサー

NO.3です。
non-essential amino acidsはGIBCOなど主要な培養液を販売しているメーカーで購入できます。100倍「希釈」でだいたい使用します。
ロットチェックですが、出入りの業者のヒトに血清のロットチェックがしたいと持ちかけてみてください。血清は高価なものですので、喜んで10-30ml程度の小分けにしたロットサンプルをもってきてくれます。頼むときにデリケートな細胞でFBSでも何種類か試さないとだめかも。といっておくと2-3種類はもってきてくれると思います。出入り業者数社に声をかければ合計でかなりの数を試せますが、数日後「で、血清どうでした??」攻撃にあいますので覚悟はしておいてください。
どれも違いが無くて、購入に踏み切れない場合には、あいにくどれもいまいちでしたといって、文句を言われることはありませんので思い切って頼んでみてください。試し方は簡単でそれらの小分けの血清を同じように別々のDMEMにいれて、元の培養液と比較すればいいのです。時には数週間培養を続けないと差が見られない場合もありますが、今の場合がんがん増えるのが目的であれば、増殖曲線を書くなどして比較知ればいいでしょう。ちなみに全部増殖がいい場合などは血清量を1%などにしたりして比較しますが、あなたの場合には最初は10%からはじめるべきですね。

ひとつだけ疑問があります。あなたの今の細胞の増殖は本来の増殖に比べて著しく遅いのですね。本来というのは文献なり、ATCCの資料と比べてということです。繊維が細胞というのは時に形質を転換することがあります。CSで培養しないと行けない細胞をFBSで培養した為に癌化してしまったということもあります。この例などはCSよりもFBSの方がよく育つからと言う理由で勝手にFBSに変えてしまった為に、普通に培養していても形態の違う細胞が出てきてしまうというものです。
貰ったものが普通で、あなたの培養していたのが異常を起こしていたということはないですか?以上な増殖でゲノムが不安定になり結局死んでしまったなんて逆説的なことも考えるのは研究者の悪い癖ですね。
失礼。

NO.3です。
non-essential amino acidsはGIBCOなど主要な培養液を販売しているメーカーで購入できます。100倍「希釈」でだいたい使用します。
ロットチェックですが、出入りの業者のヒトに血清のロットチェックがしたいと持ちかけてみてください。血清は高価なものですので、喜んで10-30ml程度の小分けにしたロットサンプルをもってきてくれます。頼むときにデリケートな細胞でFBSでも何種類か試さないとだめかも。といっておくと2-3種類はもってきてくれると思います。出入り業者数社に声をかければ合計でか...続きを読む

QBSA溶液の作り方。

(1)1%のBSA溶液を作る場合、100mlの純水に1gのBSAを加えればいいのでしょうか?
(2)スライドグラスにBSAをコートすると精子がくっつきにくくなると聞いたのですが、なぜでしょうか?BSAにはどのような作用があるのでしょうか?

Aベストアンサー

(1)だけですが、
1%という言い方をした場合、通常はw/w(重量/重量)を指すので、99mlの純水に1gのBSAですね。全部で100gとなり、そのうち1%がBSAです。
また、溶液を作るときはかき混ぜるとダマになったり泡だったりするので、水の上にBSA粉末を乗せて静置して溶けるのを待ちます。

Q形質転換、形質移入、形質導入について

形質転換、形質移入、形質導入、という言葉の違いが分からなくなりました。形質導入はtransductionでファージを介しして菌にDNAを導入することで、形質移入はtransfectionで細胞にエレクトロポレーション法などで工学的に導入することで、形質転換はDNAが導入されて形質が変わる事を指すので、細胞、菌、両者とも形質転換した、と言えるのですよね?形質転換、形質導入の違いは、DNAを導入する際のベクターがプラスミドかファージの違い、とある本もあってますますこんがらがりました。ベクターの違いなのか、導入される物(菌か細胞(cos7など)で分けてるのか、また現象をさしているのか操作をさしているのか曖昧です。どなたか教えて下さい。

Aベストアンサー

日本語訳は知りませんので、適当な教科書を見てください。

transformation
細菌に遺伝子導入を行い、形質転換した株を得る操作
動物細胞で、ガン化する現象

transfection
動物細胞に遺伝子導入を行う操作

tansduction
細菌で、バクテリオファージを介して、細菌由来のDNAが他の株に移動する現象

QウィルスDNAのORFとはどういう機能をするところですか

よくウィルスのDNAシーケンスの区分を見ているとORFという巨大なbp数の領域がありますが、ここは何をしている部分でしょうか。

Aベストアンサー

ORFはnoname#4684さんがおっしゃるように転写後、翻訳されてタンパク質ができる領域です。これはウイルスに限らず他の生物でもORFと言います。普通は最初のATG(開始コドン)から終始コドンまでを指します。ウイルスのORFから発現されるタンパク質がどのような働きをしているかは、分かっているものと分かっていないものがあります。ただ、少なくとも、この領域にはウイルスの増殖に必要なタンパク質が含まれています。
ORFの上流と下流には通常「非翻訳領域(UTR)」と呼ばれる領域があります。UTRは読んで字のごとく、翻訳されないので、タンパク質はできません。しかし、UTRは正しく転写や翻訳の開始や終結をするための配列が含まれていて、この領域がないとウイルスは増殖できません。

いろいろ書きましたが、ORFとそれ以外の領域の違いを簡単に言えば、その領域からタンパク質ができるかどうかです。出来ない領域の中には転写や翻訳の制御をしている領域もありますが、何の意味もない場所もあります。ウイルスの場合は極端に単純化しているので、全く意味のない領域というのは少ないかもしれません。

ORFはnoname#4684さんがおっしゃるように転写後、翻訳されてタンパク質ができる領域です。これはウイルスに限らず他の生物でもORFと言います。普通は最初のATG(開始コドン)から終始コドンまでを指します。ウイルスのORFから発現されるタンパク質がどのような働きをしているかは、分かっているものと分かっていないものがあります。ただ、少なくとも、この領域にはウイルスの増殖に必要なタンパク質が含まれています。
ORFの上流と下流には通常「非翻訳領域(UTR)」と呼ばれる領域があります。UTRは読んで字...続きを読む

QpcDNAっていうベクターつかった事のある方。。。

分子生物初心者でよくわからないんですが・・・
pcDNA3っていう哺乳動物用のベクター、ご存知の方に質問したいのです。

pcDNA3に、発現させたい目的遺伝子を組み込んだ場合、N末ないしC末にtagって付加されますか?
ベクターの構造をみてもさっぱりで;特にtagに関する表記はされてないように思うのです。じゃぁ、発現させた後は、その目的タンパクの抗体で検出するしかないの?と感じています。
それとも、大腸菌用ベクターで予めtag付きで構築して、その付加されたtag部分もろとも切り取って、pcDNA3に組み込んで、tag付きタンパクとして発現させるんでしょうか??

ベクター構築初挑戦?者の質問ですので、表現が変だったらごめんなさい。

Aベストアンサー

目的タンパク質遺伝子のみではタグは付加されないはずです。

もし、タグを付けたい場合はおっしゃっているとおり
タグ付きの配列を入れる必要があります。

別に大腸菌のベクター由来じゃなくても入れることは可能です。ヒスタグの様に短ければプライマー内にヒスタグ配列をデザインすることで簡単に付加できます。それ以外でも制限酵素サイトと含めたプライマーでPCRすることでMCSに遺伝子を導入することが可能です。ただしフレームがずれないように注意する必要があります。


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