HUVECという細胞の表面に発現する接着分子(ICAM-1、VCAM-1、E-selectinなど)を測定しようと考えています。実験方法を論文で調べていて、わからないところがあるので、経験者の方など、分かる方がいらっしゃったら教えてください。2つあるので、分かるほうだけでも回答いただけると幸いです。

1)1つの論文中にELISAとCell-ELISAの2種類が出てきたのですが、これはどう違うのでしょうか?検索したのですが、よく分かりません。

2)ELISA法では、96wellプレートに細胞を播種しているものが多いように思います。実験系の都合上、ディッシュにしか細胞を播くことができません。ディッシュに播いた細胞でも、ELISAで測定することはできるのでしょうか?マイクロプレートリーダーが96wellでなければいけないのは理解していますが、最初から96wellに播かないと実験できないのでしょうか?

分かる方がいらっしゃいましたら、ぜひ教えてください。
よろしくお願いします。

A 回答 (2件)

1)測定対象を抗体でplateに固定するのがELISA、接着分子のように細胞表面にある場合に、細胞ごとplateに固定するのがCell-ELISAだと思います。



2)コストを気にしなくてよいのであれば、どんなdishでも可能です。
吸光度系で1サンプルづつ測ればよいのですから
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この回答へのお礼

ディッシュで実験しても大丈夫なのですね。
ありがとうございます!

お礼日時:2007/04/15 22:00

訂正


Cell-ELISAは「細胞表面にある場合に」限らず
細胞内蛋白でも可能です
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Q細胞の呼吸

細胞の呼吸(中2の2分野)で、養分+酸素→二酸化炭素+水+エネルギーとありました。。ちょうど一分野の化学をその単元の後にやっています。この細胞の呼吸は化学的、化学式的にはどういう変化が起きているのでしょうか。ご存知の方がいたら教えて下さい。よろしくお願い致します。

Aベストアンサー

こんばんは

中学2年生ですか?
細胞の呼吸の内容はちょっと難しいかもしれません。
詳しく解説されているサイトを紹介します。
http://rc28092.rc.kyushu-u.ac.jp/%8D%D7%96E%90%B6%95%A8%8Aw/%8D%D7%96E%90%B6%95%A8%8Aw%8Du%8B%60%83m%81%5B%83g.html#Anchor1719068

大学生用に説明がされていますが、化学が好きな人でしたらがんばれるかもしれません。

こちらの目次に「解糖系」、「クレブス回路」、「電子伝達系」というのがあります。
これらが細胞の行っている「呼吸」になります。
「養分」はブドウ糖でエネルギーは主にATP(アデノシン三リン酸)です。
NADHなどもエネルギーを運ぶ物として作られます。
ブドウ糖を少しずつ分解していく部分を「解糖系」と呼びます。
分解してできたピルビン酸をアセチルCoAに変換してクレブス回路(TCAサイクル、クエン酸回路も同じもの)でさらに分解してエネルギーを取り出します。
化学反応がぐるぐる回っているように見えるので「回路」と呼びます。
電子伝達系でもATPが作られます。

アミノ酸(タンパク質)や脂肪などの他の栄養素は別なルートを通りますが、どこかでTCAサイクルとつながっています。
中学の教科書より少し詳しい話は高校の生物で習います。

こんばんは

中学2年生ですか?
細胞の呼吸の内容はちょっと難しいかもしれません。
詳しく解説されているサイトを紹介します。
http://rc28092.rc.kyushu-u.ac.jp/%8D%D7%96E%90%B6%95%A8%8Aw/%8D%D7%96E%90%B6%95%A8%8Aw%8Du%8B%60%83m%81%5B%83g.html#Anchor1719068

大学生用に説明がされていますが、化学が好きな人でしたらがんばれるかもしれません。

こちらの目次に「解糖系」、「クレブス回路」、「電子伝達系」というのがあります。
これらが細胞の行っている「呼吸」になります。
「養分」...続きを読む

Q96wellプレートかたの細胞のはがし方について

基本的な質問で申し訳ありません。
現在、96wellプレートでHeLa細胞の増殖曲線を描こうとしています

最初の1,2日目は比較的きれいにはがれるのですが、その後日を経るにつれてはがれが悪くなってしまい、きれいにはがすことが出来ず、正確な数が測定出来ない状態です。

プロトコールとしては、培地を除去した後に、20μlの0.05%トリプシンを処理後、37℃で3分間インキュベートし、その後80μlの培地を入れてピペッティングを行うことではがしています。(ちなみに20μlではwell全体にいきわたっておらずそれも原因の一つかと考えております。)


もともとトータルの液量もあまり多くないため、全体をはがそうとして、ピペッティングの回数を増やしますと、泡だってしまうのでそれもどうにか避けたい状況です。


96wellプレートで、細胞の良いはがし方がありましたら教えていただけると光栄です。宜しくお願いいたします。

Aベストアンサー

>培地を除去した後に、20μlの0.05%トリプシンを処理後、37℃で3分間インキュベートし、

PBSで1度、もしくは2度洗ってみてください。インキュベートは10分くらいでもいいです。いずれにせよ、顕微鏡下で、完全にはがれていることを確認します。

>その後80μlの培地を入れてピペッティングを行うことではがしています。

PBSを代わりに入れてみてください。

Qブドウ糖と各細胞のエネルギー源について教えて欲しいのですが、ネットで調

ブドウ糖と各細胞のエネルギー源について教えて欲しいのですが、ネットで調べると脳細胞や赤血球はブドウ糖をエネルギー源していると書かれていますが、それ以外のいろんな部位の細胞はブドウ糖をエネルギー源にはしてないのですか??筋肉、肝臓、胃、すい臓、腎臓、、etcこれらの細胞のエネルギー源って何ですか?

Aベストアンサー

細胞は、ブドウ糖、タンパク質、脂肪から
解糖系-クエン酸回路-電子伝達系を経て
ATPをつくりATPが細胞のエネルギーになります。
ですので、上記3つがエネルギー源になります。
脳細胞も細胞なので本当は上記3つがエネルギー源なのですが
血液脳関門という脳を守るための関門があり、タンパク質、脂肪がそこを通過できないので
脳の栄養はブドウ糖だけに結果的になります。

Qディッシュ、マイクロプレートについて

今、接着性の細胞を育てています。
そこで質問なのですが、
実験の際に24穴プレートで細胞観察し、
得られたデータはデータとしてどうなのでしょうか?
というのも、論文では結構24穴でなさっている方が
いらっしゃるのですが、24穴の場合どうしても水面が平らにならず、薬剤などの濃度依存性を調べるとすると
濃度勾配ができてしまうような気がするのですが…
一般にどのように考えられているかご存知の方
よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

形態観察の場合は、普通は、細胞が接触しあわない、してもまだ隙間がある状態で観察するのが普通です。

コンフレントの条件での形態観察というのはそれはそれでありますが、通常のものとは違い、特別なもの、例えばがんの異常増殖性をみるときはしたりしますが。

ちなみに免疫染色などではともかく、たんなる形態観察ならわたしは大きなプレートでやりますけどね。
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どちらにしてもいわゆるワンショットではたしかに「いいとこどり」のデータになることはある程度はしょうがありません。ですので最近ではグラフ化したものをつけたりすることもあります。どっちにしても主観を抜け出れるとは思いませんけど。

言える事は、実験と言うのは再現性が問題視されますから、同じ条件で再現性があれば、とりあえずはセーフだと捉えられています。

Q筋肉細胞のエネルギー源についてですが、糖、脂質、タンパク質がエネルギー

筋肉細胞のエネルギー源についてですが、糖、脂質、タンパク質がエネルギー源になるみたいですが、主に速筋のエネルギー源は糖で遅筋の方は脂質ですよね。そこでなのですが、筋細胞のタンパク質が分解されて糖新生で作られた糖は速筋で使われるのですか?遅筋で使われる脂質は体中にいっぱいあるので不足することはないのでしょうか。

Aベストアンサー

> 筋細胞のタンパク質が分解されて糖新生で作られた糖は速筋で使われるのですか?

空腹時に運動すると筋肉が分解されると言われます。
そうだとすると、速筋は自分が使うエネルギーを作るために、自分自身を分解することになり、自己矛盾に陥ってしまいます。あなたがこの疑問点に行きついたことは、当然だと思います。

糖新生で作られた糖は筋細胞が使うのではなく、脳が使います。
脳は人体で最も大切な臓器で、糖が途絶えると致命的なので、身体は筋肉を分解して糖を作り、脳に供給します。

脳の血管関門は細くなっていて、糖だけが通過でき、脂肪や蛋白質が通過できない仕組みになっています。
筋肉の場合は糖も脂肪も燃やせますが、脳は糖しか燃やせないので、もしも糖が欠乏すると、筋肉を分解して糖を作るしかないのです。筋肉のために分解するのではありません。

体内には、肝臓に100g、筋肉に300gの糖が貯蔵されています。
脳は肝臓に貯蔵された糖を使います。脳は1時間あたり6gの糖を使います。
食後、時間が経過して肝臓の糖が半分位になると、脳は空腹信号出して、次の食事を催促します。

一方、筋肉に貯蔵された糖は、運動しなければ減りません。
筋肉には糖の分解酵素がないので、肝臓の糖が少なくなっても、筋肉の糖を譲ることができません。
運動時には、筋肉は血液中の脂肪を取り込んで燃やし、パワーを出すときにだけ、筋肉に貯蔵した糖を燃やします。
このように、脳と筋肉のエネルギーシステムは独立しているので、空腹時に運動しても、筋肉のために筋肉を分解することはありません。

筋肉が分解されるのは、肝臓の糖が枯渇に近づいたときです。
肝臓の糖が枯渇に近づくと、脳のエネルギーが途絶える前に、筋肉が分解されて糖新生されます。
一般に、肝臓の糖が半分以下になると空腹を感じますが、それから8時間以上放置すると糖新生が起こります。
ですから、空腹時に運動しても、長時間でなければ筋肉が分解されることはありません。
以上のことを前提に、もう一度考察しなおしてみてください。そうすると、すべてが符合すると思います。

> 遅筋で使われる脂質は体中にいっぱいあるので不足することはないのでしょうか。

遅筋は血液中の脂肪酸を取り込んで燃やします。
血液中の脂肪は、濃度が低下すると、すい臓からグルカゴンというホルモンが分泌し、体内に無尽蔵に貯蔵されている脂肪を溶かしだすので、血液中の脂肪が不足することはありません。

褐色脂肪細胞は血中の脂肪酸を取り込んで産熱します。
白色脂肪細胞は中性脂肪を貯蔵します。

> 筋細胞のタンパク質が分解されて糖新生で作られた糖は速筋で使われるのですか?

空腹時に運動すると筋肉が分解されると言われます。
そうだとすると、速筋は自分が使うエネルギーを作るために、自分自身を分解することになり、自己矛盾に陥ってしまいます。あなたがこの疑問点に行きついたことは、当然だと思います。

糖新生で作られた糖は筋細胞が使うのではなく、脳が使います。
脳は人体で最も大切な臓器で、糖が途絶えると致命的なので、身体は筋肉を分解して糖を作り、脳に供給します。

脳の血管関門は...続きを読む

Q論文を読んでいて、細胞を用いる実験で、グルコースの濃度をふって実験をい

論文を読んでいて、細胞を用いる実験で、グルコースの濃度をふって実験をいているデータが載っているのですが、何の目的なのでしょうか。
ごく一般的な手法なのか、理由は書かれていなかったので、どなたかご教授よろしくお願いします。

Aベストアンサー

グルコースの濃度を振るのは一般的ではないので、その理由は論文中に(直接的ではなくとも)記述してあるでしょう。

Q細胞のエネルギー変換

ふと疑問に思ったので教えてください。

細胞のエネルギー変換はどのように行われるのでしょうか?
説明お願いします。

Aベストアンサー

こんにちは。
我々の身体を構成するあらゆる細胞の活動エネルギーは「ATP反応」によって賄われており、ATPの90%がミトコンドリア内で合成されています。
「ATP(アデノシン三リン酸)」は、「ADP(アデノシン二リン酸)」と「P(リン酸)」に分解されることにより、12Kcal/molのエネルギーが得られます。このエネルギーが細胞の活動に使われます。
分解されたあとのADPとPは、再びATPを再合成するための材料としてミトコンドリアに送り返されます。ミトコンドリアでは分解されたADPとPをくっつけて、それをATPに作り直すわけですね。この「ATPの再合成」に使われるエネルギーは、各細胞に栄養として分配される「グルコース」を分解・反応させることによって作られます。
ですから、細胞は送られて来るグルコースのエネルギーを一度ATPの合成に使い、そのATPを分解することによって自分が活動するためのエネルギーを得ているわけですね。ATP1molから得られるエネルギーが12Kcalであるのに対し、その再合成には18Kcalが必要ですから、ATP反応のエネルギー変換効率は66%ということになります。

ATP合成、即ちグルコースの分解過程には「無機代謝」と「有機代謝」がありますね。
「無機代謝(解糖)」では、細胞に送られたグルコースがピルビン酸に分解される過程でATP2mol分のエネルギーを放出します。この分解反応はミトコンドリアの外で行なわれ、酸素も必要としないので、合成されたATPは直ちに使用可能なのですが、量が少ないので長続きはしません。無酸素運動というやつですね。
このあと、ピルビン酸は水素とアセチルCoAに分解されてミトコンドリアに送られるのですが、この先が「有機代謝」になります。

水素と共にミトコンドリアに送り込まれたアセチルCoAも、そこで最終的に水素と二酸化炭素にまで分解されます。この過程でATP2molが合成できます。そして、このようにしてグルコースから取り出された水素を、呼吸によって取り込んだ酸素で燃焼させることによって、ミトコンドリアでは大量のエネルギーが得られます。これらを合計しますと、分配されたグルコース1molを完全に分解・燃焼させることによって、細胞内では456Kcal分のATPが使用可能になります。

こんにちは。
我々の身体を構成するあらゆる細胞の活動エネルギーは「ATP反応」によって賄われており、ATPの90%がミトコンドリア内で合成されています。
「ATP(アデノシン三リン酸)」は、「ADP(アデノシン二リン酸)」と「P(リン酸)」に分解されることにより、12Kcal/molのエネルギーが得られます。このエネルギーが細胞の活動に使われます。
分解されたあとのADPとPは、再びATPを再合成するための材料としてミトコンドリアに送り返されます。ミトコンドリアでは分解され...続きを読む

Q細胞を抗原とするELISA、固定法について

細胞を免疫吸着剤とするELISA法をためしています。
細胞表面抗原は、グルタルアルデヒド、パラホルムアルデヒドでの固定でうまくいったのですが、細胞内抗原はうまくいきません。
おそらく固定法に問題があるのだと考えています。

アドバイスよろしくお願いします。

Aベストアンサー

補足です。
ELISAではないですが、免疫蛍光染色では経験上、細胞内でもさらにオルガネラの内側の膜にある抗原が標的だったりすると界面活性剤の種類で、抗体反応に大きな差が出ることがあります。
tweenで十分な気もしますが、一次抗体の良し悪し関係してくるので今の情報では難しい問題ではないかと思います。
ほかには界面活性剤の種類や濃度、ブロッキング剤の種類、一次抗体の反応時間等振ってみるのが無難な気もします。あと、二次抗体(HRPconjugatedなど)の種類(メーカー)によっても結構差がでるので、そこは考慮したほうがいいとも思います。
基本的なことしか答えられずに申し訳ありません・・・。

Q呼吸で得られるエネルギーの計算

生物学を学習していてわからないところが出てきました。初歩的なことかもしれませんがよろしくお願いします。
好気呼吸の化学式はわかるのですがそこで発生するエネルギーの求め方がわかりません。
好気呼吸の化学式
   C6H12O6+6O2→6CO2+12H2O+686Kcal(38ATP)
この式で38ATPが生産させるのはわかるのですが686Kcalはどのようにして求めるのでしょうか?
書籍(生物学)では熱力学的な計算によって求めるとしか記述していなく詳しい求め方がわかりません。
回答よろしくお願いします。

Aベストアンサー

>計算による手法
ですか。
それでしたらヘスの法則を用いるのでしょうか。
反応物と生成物が同じであるのならば、反応はどんな経路をたどったとしても、最終的な熱量の収支は決まった値になるってやつですね。

C6H12O6+6O2→6CO2+12H2O+686Kcal

C6H12O6 + 6O2 (式の左辺)の中の共有結合を全て切断してばらばらにするのに必要なエネルギーと、そのばらばらになった原子が共有結合することによって
6CO2 + 12H2O(式の右辺)ができたときに放出されるエネルギーの差が 686kcal になっているのだと思います。
C=O結合、C-O結合、O-H結合、O=O結合、C-C結合などのの結合エネルギーなどはわかっているので、これらの値から計算することができます。

QELISAプレートの洗浄法について教えてください.

こんにちは.初めて質問します.
kitではなく,自分で抗原(細胞株)をプレートに
coatingしてELISAをしているのですが,手動で
プレートを洗浄する方法を教えて下さい.

先輩から,プレートが割れるくらい強く何度も
たたきつけて洗えと言われるのですが,そこまで
必要なのかなかなか信じられません.要は洗浄液
が除去できればいいと思うのですが,デカントした
後,軽くキムタオルの上で吸水させるだけでは
やはり不十分なのでしょうか?
また,抗原が細胞株だからかなのか分かりませんが,
洗浄液はD-PBSで,tweenなどが入っていません.
(ラボのプロトコールでそうなっています.)
tweenなど入れると,細胞表面抗原などに悪影響
なのでしょうか?

以上,よろしくお願いします.

Aベストアンサー

ELISAをキットなど用いずに行っているものです.

ただ私は蛋白質をそのままコーティングしているので
畑違いだと思います.ですがどの程度違うのかわからないので
一応書き込みだけしておこうと思い、書き込みました.
(ですから専門家ではなく経験者にしました)
あとはTweenを0.05%で使っています.
入れるか入れないかで結果が大きく異なる場合もありましたのですが、、、
悪影響があるかもしれないのでは入れられませんね

あくまでも蛋白質をコートする場合であればの話ですが
そこまでたたかないでも上手くいっています.
というよりたたかないでもうまくいきます.
昨年末も大学での模擬授業のためにきた高校生にやらせて
たいていの子が成功しました.
ヒト血清そのままをもちいて
花粉症の診断のためELISAを行ったこともありますが
若干の変更でたいていがうまくいきます.

一点だけ以前ある抗原と抗体にだけ
どうしても綺麗なデータが出なかったとき、変えたのが二次抗体でした.
抗原と二次抗体の相性はあると思います.
標識つきモノクロ抗体を使っているのでしたら関係ない話ですが

お役に立てる話であればいいのですが

ELISAをキットなど用いずに行っているものです.

ただ私は蛋白質をそのままコーティングしているので
畑違いだと思います.ですがどの程度違うのかわからないので
一応書き込みだけしておこうと思い、書き込みました.
(ですから専門家ではなく経験者にしました)
あとはTweenを0.05%で使っています.
入れるか入れないかで結果が大きく異なる場合もありましたのですが、、、
悪影響があるかもしれないのでは入れられませんね

あくまでも蛋白質をコートする場合であればの話ですが
そこまでたたかな...続きを読む


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