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GEANCLEAN II KIT を用いてDNAを回収していますが、とても効率が悪くて困っています。効率を高めるような秘訣ってありませんか?説明書的なものでも結構です。

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A 回答 (5件)

GENECLEANって回収悪いですよね。


(うっている会社には怒られてしまいそうですが・・・。)
わたしも、昔やって、うまくいかなかった経験があります。
ガラスビーズが最終的に混ざるし。
もしも、ほかのKITをためす気があれば、QIAGENのQIAEX GEL Extraction Kitをおすすめします。すごく簡単できれいに確実にとれます。
150個で25000円なので、コストパフォーマンスもまずまずです。

古典的な方法でもよければ、フェノール抽出法でしょう。

1.低融点アガロースで、泳動して、切り出したら(できるだけ小さく切るのがポイント)、300マイクロリッターになるようにTEバッファーを加えます。

2.65度で溶けるまで(~10分)インキュベートして、溶けたらすぐに、等量のTE飽和フェノールを加え、よく混ぜて、15000rpm、室温で5分遠心します。

3.上清を新しいチューブに移し、再度、等量のフェノールを加え、よく混ぜて、15000rpm、室温で5分遠心します。

4.上清を新しいチューブに移し、等量のクロロホルム(クロロホルム:イソアミルアルコール=24:1)を加え、よく混ぜて、15000rpm、室温で5分遠心します。

5.上清を新しいチューブに移して、1/10の3M酢酸ナトリウム(pH 5.2)と3倍量のエタノールを加え、-80度、20分(-20度なら、もう少し長め)冷やして、15000rpm、4度で20分遠心します。

6.上清を捨てて、70%エタノール100マイクロリッター加え、再度15000rpm,4度で5分遠心して、上清を捨て、乾かしたら、TEバッファーに懸濁して終了です。

フェノールは手に付けるとやけどしますので注意してください。
この方法はなれればすごく回収率もいいですが、やっぱりおすすめは、QIAGENのKITかなあ。
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この回答へのお礼

プロトコルまで書いていただいて、とても感謝しています。
早速、QIAGENについて指導教官と相談してみます。

お礼日時:2001/01/19 14:11

ライゲーションが上手くいかないのではなく回収段階ですね。



鉄則

上手く出来る人と一緒にやる。
方法やkitを換えてみる。
量だけの問題でしたら。スタートマテリアルの量を増やす。
配列によっては回収率が悪いものもあるのでポジコンで確認を。

ライブラリーの作製ではないですよね。

具体策(簡単に)
加温時間を長く
洗いは慎重に
溶出volを下げることで(同じ回収量だとしても)濃度を上げて、ライゲーション時に高濃度で持っていく。

まわりも駄目な時はビーズが変になっている(原因不明)の場合あり。

わかりにくければ補足要求してください。
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この回答へのお礼

二度にわたるアドバイス、ありがとうございました。

お礼日時:2001/01/19 14:18

私もGEANCLEAN IIを使って精製していました。

(卒研時)
やはり収集率が悪かったので、ガラスパウダーを洗浄してDNAを回収するループを1回多く回していました。
ただし、最後の1回分は不純物が心配だったので、別に保存し、最初の産物の結果次第で使ったり使わなかったりしていました。
でも、あまりおすすめできませので、収率を上げるためにはKITに頼らないプロトコルをお勧めします。手元にメソッドがないので直接的な資料を提示できませんが、指導教官に相談するか、DNA抽出を専門的に扱っている大学研究室に電話をするかメールをして、代表的なプロトコルを薦めてもらってください。
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この回答へのお礼

アドバイスありがとうございます。
でも、DNA抽出を専門的に扱ってる研究室ってうちなんですよね。
しかも大学じゃなくて国立の機関で(笑)
まあ、私の経験不足が一番の原因かもしれないですね。

お礼日時:2001/01/19 14:16

以前、卒論でDNA Seqenceのしていたんですが、dsDNAの単離の際にジーンクリーンを使ったことがあるんですが、回収率が悪く(泳動ゲルから分離すること自体がコンタミの原因だったような)、2.3度試してやめた覚えがあります。

当時のプロトコールを見たんですが、もう5年も前のことで英語のプロトコールを読めませんでした。どうもゴメンナサイ。
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 質問なのに質問で返すのは良くないですが、これは大腸菌でDNAを増殖させて


これをキットで回収しているのですか??

 もしそうならば、 1 大腸菌濃度が濃かったり、薄かったりしている
         2 大腸菌君自体の調子が良くない
         3 大腸菌中のDNAの増殖が極端に少ないか、
           多くなっている。
 というのが考えられます。

 次に、プロトコールをもう一度良く読んで実験方法があっているか確認
 しましょう。
 使用するプラスミドの種類によっては、使用する試薬、量、濃度が違ってきま
 すので確認しても良いと思います。あとDNAの長さでも同じ。

 んんーでも一応DNAは少しながら回収出来ているのだから、回収する物自体が
 やっぱり良くないのでは??

 昔、植物のDANを、フェノール抽出法で行っていたのだが、(フェノールが手にこぼれたりして怖かった)、温度とかには注意してましたからね。
 あと鳥のDANを取っていた時も、核が多い肝臓を使って採取してましたからね。
 
 昔の実験を参考にしました。
 もしよかったらGEANCLEAN II KIT の簡単なプロトコール教えて下さい。
 

この回答への補足

アドバイスありがとうございます。
私の質問が大雑把なため誤解が生じたかもしれませんが、
質問のDNAの回収はライゲ-ションの前の段階で、
ゲルから切り出したDNAを精製する段階のことです。
GEANCLEANはNaIでアガロースを溶解させ、DNAをガラスパウダーに
吸着させて回収する方法です。

補足日時:2001/01/17 19:06
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