素朴な疑問なんですが、トランスフォーメーションのとき
手順の最初の方では、コンピテント細胞がくずれるからと言って
やたら慎重に扱うわりには、終盤で震盪器やら遠心分離器を
使えるのは何故なんでしょうか?

A 回答 (2件)

最初の方で慎重に扱うというのがどういうことを指すのかが具体的にはわからないのですが,コンピテントセル(大腸菌)を氷中で取り扱うと言うことでしょうか?



もしそうであるならば,それはひとえにトランスフォーマントを高効率で得るためです.
最初のうちは,出来る限り低温の状態で取り扱い,ヒートショックをかけた(37℃~42℃)後は,形質転換した大腸菌を少しでも増やすために,大腸菌の分裂を促進させたり,プレートにまく大腸菌の濃度を上げるためです.
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プロトコルの手順とその理由を一つ一つちゃんとおっていけば、終盤で震盪器を使える理由が納得できると思いますので、再度プロトコルを確認して下さい。



たしか、後半で細胞の安定性が増すか、コンピテント・セルは震盪や一方向のGには強いかのどちらかではなかったかと思うのですが・・・
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Q遠心分離機 スイングローターとアングルローター

遠心分離機にはスイングローターのものとアングルローターのものがあると思うんですが、それらの用途を調べていたら、スイングローターは密度勾配沈殿法に適していて、アングルローターは分画沈殿法に適していると書かれていました。しかし、理由はわかりませんでした。

分かる方回答お願いします。

Aベストアンサー

まず、密度勾配遠心に適する適さないという視点で
スイングローターはある程度回転数が上がると、中に入っている試験管が真横を向きますよね?
試験管の位置は、|の状態から―になり、回転中の重力は→なわけです。
従って試験管の底に向かって、真っ直ぐ力がかかります。
密度勾配による層がきれいに水平になるわけです。
一方、アングルローターは良くて45°の角度で固定です。
試験管の位置が\なのに、回転中の重力は→なわけですね。
これではきれいな層が出来ません。
従って、密度勾配遠心にはスイングローターが適しているわけです。

次に分画沈殿に適する適さないという視点で
上述した通り、スイングローターは試験管真下に力がかかるので、沈殿は試験管の底に落ちます。
アングルローターは、角度がついていますので、真下には落ちません。
底部の壁面にへばりつく形になります。
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やってみないとイメージしにくいかと思うのですが、そうなのです。
そんなわけで、分画沈殿にはアングルローターが適しています。

まず、密度勾配遠心に適する適さないという視点で
スイングローターはある程度回転数が上がると、中に入っている試験管が真横を向きますよね?
試験管の位置は、|の状態から―になり、回転中の重力は→なわけです。
従って試験管の底に向かって、真っ直ぐ力がかかります。
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一方、アングルローターは良くて45°の角度で固定です。
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Q細胞小器官の遠心分画法について

いつもお世話になっています。

ブタの肝臓をハサミで細切した後、テフロン・ホモジナイザーにかけてホモジネートを作製、遠心して核・ミトコンドリア・リソソームなどに分画しています。
それぞれの画分の純度はマーカー酵素活性の測定と電子顕微鏡による観察でチェックしています。
しかし、酵素活性でも電子顕微鏡でも、どうやらきちんと分画できてないらしいことがわかりました。
精製にするにつれて高くなってほしい比活性が低下したり・・・
電顕でもミトコンドリアなどはマトリックスの構造がちゃんとしてなくて、「ほんとにミトコンドリア?」ってくらいです。
大きさとしては2μmくらいの小胞が並んでいるのでミトコンドリア(の残骸)なんだろうと推測するしかない感じです。

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いつもお世話になっています。

ブタの肝臓をハサミで細切した後、テフロン・ホモジナイザーにかけてホモジネートを作製、遠心して核・ミトコンドリア・リソソームなどに分画しています。
それぞれの画分の純度はマーカー酵素活性の測定と電子顕微鏡による観察でチェックしています。
しかし、酵素活性でも電子顕微鏡でも、どうやらきちんと分画できてないらしいことがわかりました。
精製にするにつれて高くなってほしい比活性が低下したり・・・
電顕でもミトコンドリアなどはマトリックスの構造がちゃん...続きを読む

Aベストアンサー

ブタの肝臓を使用させる場合、結合組織等が邪魔をするためにガーゼなどのメッシュで一度細胞だけにしてからホモジネートします。
凍結融解は、それだけで細胞が壊れますが細胞内のオルガネラにはそれほど影響を与えないと思いますが・・・
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Qライゲーション→トランスフォーメーション

ライゲーション→トランスフォーメーションが上手くいきません.
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しかし,コロニーを拾ってMiniPrepし,適当な制限酵素で切断したりしてアガロース電気泳動すると予想だにしないバンドが出てきます.20個くらいに対し1個は予想されるところにバンドはくるのですがセルフです.

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ベクター(10 kb...続きを読む

Aベストアンサー

#1です。

>インサートは,元々プラスミドの中にBgl II-insert-BamH Iで入っていたものを切り出して,ゲル抽出により精製しました.精製後のinsertはアガロース電気泳動で確認しました.

>泳動バッファーは新しいものを使いました.染色液は使わず,エチブロをはじめに入れたゲルを使いました.

了解です。

だとすると、変な断片がやってくる余地はあまりなさそうですね。
切り出しを低波長の紫外線下で長時間かけて行ってしまって、変な断片になってしまったということもあり得なくはないでしょうが。

残る疑問点は、
>20個くらいに対し1個は予想されるところにバンドはくるのですがセルフです.

というところですが、10kbと12kbなら、はっきり区別がつくはずですよね? だとすると、予想されるところにきたバンドがセルフというのはどういうことでしょう?

あと、予想だにしないサイズというのは、具体的には?

ベクターまたはインサートに、繰り返し配列等がないとすると、再編成がおこる可能性はあまりありませんね。
インサートは、大腸菌内で有害な作用をする可能性があるものでしょうか。だとすると、変なことが起こる可能性は大きくなりますが。

あと考えられるとすると、切り出しのときに、間違ってインサートじゃなくてベクターのバンドを切り出してしまってたりはしませんよね。

あとは、TEなどに、プラスミドが混入している可能性もありますが、同じものをネガコンにも同様に使っていたなら、その可能性はほぼ無視できますね。

とりあえず、最初からやり直してみることをお勧めします。

それでもうまくいかない場合は、低コピー数のベクターを使うとか、pUC系のベクターなら、培養温度を下げてコピー数を少なくしてみるといったことも有効かもしれません。

#1です。

>インサートは,元々プラスミドの中にBgl II-insert-BamH Iで入っていたものを切り出して,ゲル抽出により精製しました.精製後のinsertはアガロース電気泳動で確認しました.

>泳動バッファーは新しいものを使いました.染色液は使わず,エチブロをはじめに入れたゲルを使いました.

了解です。

だとすると、変な断片がやってくる余地はあまりなさそうですね。
切り出しを低波長の紫外線下で長時間かけて行ってしまって、変な断片になってしまったということもあり得なくはないでしょうが...続きを読む

Qコンピテントセルについて

コンピテントセルの作製をしているのですが、各会社や注文した株によって大腸菌の種類って違いますよね?

例えばDH5α、JM109、HB101みたいに・・・

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今は最も基本的なプロトコールに従って、LB培地で培養しています。

Aベストアンサー

菌株に特異的ではありませんが、
2xYT、3xLB、TB、MMI培地などを目的によって使い分けることは出来ます。

Qコンピテントセルの作製において・・

コンピテントセルを作る時、効率の良いものをつくるため(最低でもx10の7乗)懸濁する際やエッペンに分注する時には低温室で作業すると初めに習ったのでそうしているのですが、長時間4℃にいるのはかなりきついし精神的にもしんどいです。

できたら普通の部屋で氷上で冷やしながら作業したいのですが、低温室でやらなくても効率の良くなるコツとか分かる方いましたらご教授ください。

Aベストアンサー

私達の研究室でも塩化カルシウム法で作っていたのですが、効率が上がらなかったので塩化ルビジウム法という方法に代えました。私の場合、塩化カルシウム法に比べ、効率が100倍から1000倍くらいに上がりました。うちの研究室ではJM109の場合、誰がやっても10^7をきることはなくなりましたね。

参考URL:http://www.gene.mie-u.ac.jp/Protocol/Original/Transform-Comp-Cell-Freeze.html


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