出産前後の痔にはご注意!

HPLCを行っていて、それぞれのピークの間隔が狭く、分取が難しいとき、どのような対処法を皆さんは取られますか?このようにしたらうまくピークが分かれてくれたという例がありましたら教えてください。

A 回答 (1件)

根本的な解決には溶離液の組成またはカラムの変更をお薦めします。



すぐできる、その場しのぎ的な対応としては、
・流速を下げる(クロマト時間は長くなります)
・サンプル注入量を下げる(1回の分取量減)
・同じカラムを複数直列に繋ぐ(流速も下げないと圧がかかりすぎるかも)
・オーブン温度を下げる
・前ピーク前半&後ピーク後半のみ分取する(収率減)
などが挙げられます。
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QまたまたHPLCで教えてくださいな!

えっと、HPLCのベースラインのことでお尋ねします。

ズバリ、ベースラインが安定しません。
午後中流していたのですが、ずーーーーーーっと下がって(という言い方でいいのかな?)いくのです。
蛇行したりするのではなく、とにかく下がり続けるのです。

移動相をメタノール・アセトニトリル・リン酸緩衝液のものから
メタノール・アセトニトリル・クエン酸緩衝液に変えたところでこの現象です。
セルに気泡が入ってるのかなー、とも思いますが昨日までちゃんとラインは安定していて、
カラムも変えてないし、一応脱気装置もついてるし・・・。

いったい何が原因なのでしょうか?
ちなみに測定物質は安息香酸です。

ちょっとでもヒントになることがあれば、ぜひぜひご教授ください。

Aベストアンサー

>>溶離液を頻繁に変えての系内洗浄は必ずカラムを外した上で行ってください。
>えっ、そ、そうなんですね・・・。(^^;)
>すいません、知らないことだらけで・・・。

カラムや溶離液の種類によって差異はありますが、頻繁に溶離液や圧を変更するとカラムの寿命が短くなります。カラム内の溶離液を交換する際は流量(圧)を下げ、時間をかけて穏やかにやるのが基本です。

rei00さんもおっしゃるように水で充分に洗浄したほうがよいでしょう。いきなりメタノールを通すと無機塩が析出してしまう可能性も生じてきますから。水で洗浄後、水/メタノール混合溶液→メタノール→水/メタノール混合→水、最後に使用する緩衝液といった順番で流せばいいように思います。有機物が付着している可能性があるのならば、メタノール洗浄後にアセトニトリルや場合によっては2-プロパノールで洗浄するのもいいかもしれません。


rei00さん、こんにちは。
>>溶離液を流しっぱなしにしておくと自然に問題が解決
>>することもよくあります(答えになっていないけど)。
>これは溶離液を流しっぱなしにした事で,系内の溶離液交換が完了した結果だと思いますが。いかがでしょうか。

そうですね。私が体験したトラブルの原因は、ほぼ100 %これによるものと考えています。

>>溶離液を頻繁に変えての系内洗浄は必ずカラムを外した上で行ってください。
>えっ、そ、そうなんですね・・・。(^^;)
>すいません、知らないことだらけで・・・。

カラムや溶離液の種類によって差異はありますが、頻繁に溶離液や圧を変更するとカラムの寿命が短くなります。カラム内の溶離液を交換する際は流量(圧)を下げ、時間をかけて穏やかにやるのが基本です。

rei00さんもおっしゃるように水で充分に洗浄したほうがよいでしょう。いきなりメタノールを通すと無機塩が析出してしまう可能性も...続きを読む

Q脱イオン水、MilliQ、蒸留水 の違いを教えて下さい

こんにちは。お世話になります。

バイオ、生化学系の実験に従事しているものですが「水」について教えて下さい。

水道水、脱イオン水、MilliQ、蒸留水(二段蒸留水)、超純水の違いを教えて下さい。
お互いの関係などありましたら(○○を~すると△△になる等)教えていただけると
わかりやすいかもしれません。

また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?

よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は除けません。

蒸留法は水を蒸留することで不純物を除く方法です。イオン交換法と組み合わせて2回蒸留することが一般的です。一般的な2次蒸留水の比抵抗は数MΩ・cmでバイオ・生化学関係には十分な純度です。動物培養細胞にも使用可能です。エンドトキシンも完全にフリーとまではいかないけれどもある程度の除去はできています。蒸留法は多くの不純物を除去可能ですが100度付近の沸点を持つ物質は除けません。

逆浸透法は半透膜に圧力をかけて精製する方法です。

限外濾過法は限外濾過膜を通す方法です。孔径は半透膜が数十nmに対し、限外濾過膜は数nmです。それゆえ、数kDa以上の分子であれば、限外濾過法で除けますので、エンドトキシンやRNaseなども除去できます。本当にエンドトキシンフリーな水が必要でしたら限外濾過法を行った水が必須です。ただ、普通のCOSとかHEKとかの動物細胞培養でしたら2次蒸留水でも十分です。蛍光検出用のマイクロアレイなんかは限外濾過水が必須なようです。

超純水は十数MΩ・cmの水のことです。MilliQはミリポア社の超純水装置を用いて作った水で比抵抗は15MΩ・cm以上と高純度の水です。MilliQに関してはイオン交換樹脂を通し、逆浸透法、限外濾過法を用いて精製しているようです。

>また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
これに関しては上で書いたように限外濾過膜で精製した水です。MilliQが当てはまるでしょう。(超純水も一般的には限外濾過をしているのでこれも当てはまりますかね。)

>動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?
これは、2次蒸留水以上の純度があれば十分です。2次蒸留水、MilliQ水、超純水が使用できます。

ただ、水関係の装置は日頃のメンテナンスが重要でイオン交換樹脂とか水を貯めるタンク、蛇口に汚染がないかは確認する必要があります。

実験書には必ずはじめのほうに書いてあることですので、pinokoBBさん自身でなにか実験書をご参照ください。

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は...続きを読む

QHPLCの負のピーク

HPLC初心者です。
HPLC分析結果に、どの物質を分析しても必ず1分台に負のピークが出てしまうのですが、
これはなぜなのでしょうか。
また、負のピークは本来なら出てはいけないものなのですか?
わからないことばかりですみません。
どなたかお願い致します。

Aベストアンサー

私の経験から先に結論を言いますと、負のピークがでても測定に問題ありません。
  但し、インジェクション部、カラムの接続部等に問題がないことが前提です。
  もう一度各部を点検してください。

Q検量線の計算方法について

こんにちは。
現在HPLCを扱っております。検量線を使っているのですが
計算方法がよく理解できておりません。
【化粧品100g中に有効成分Aは何g含まれているか】を求めるものです。
まず、
標準品 0g、0.1g、0.3g、0.5g を精密に量り、全て精製水で正確に
100mlとします。この各液から、さらに1mlを精密に量りとり、精製水を
加えて正確に100mlとします。

試料は 1mlを精密に量り、精製水を加えて正確に100mlとしました。

ピークのAREAですが【標準品】
0.1g→ 574221
0.3g→ 1671182
0.5g→ 2717212
【試料AREA】は1738876 です。
Excelで検量線の計算式を出したところ下記のような式になりました。
y=5E+06x + 46962  R2 =0.9998

この場合、100g中に何g含まれているかを求めるには
どうしたらいいのでしょうか?
私なりに計算して四捨五入で0.3gとなったのですが
あっているでしょうか?

長くなってしまいましたが、教えてください!

こんにちは。
現在HPLCを扱っております。検量線を使っているのですが
計算方法がよく理解できておりません。
【化粧品100g中に有効成分Aは何g含まれているか】を求めるものです。
まず、
標準品 0g、0.1g、0.3g、0.5g を精密に量り、全て精製水で正確に
100mlとします。この各液から、さらに1mlを精密に量りとり、精製水を
加えて正確に100mlとします。

試料は 1mlを精密に量り、精製水を加えて正確に100mlとしました。

ピークのAREAですが【標準品】
0.1g→ 574221
0.3g→ 1671182
0.5g→ 27...続きを読む

Aベストアンサー

ちょっと整理するために長くなりますが、順番に書きますね。

1.まず検量線に用いた標準溶液の濃度をきちんと計算しましょう。
○標品 0g、0.1g、0.3g、0.5g
 →mgに換算すると0mg, 100mg, 300mg 500mg
○全て精製水で正確に100mlとする
 →濃度は0mg/ml, 1mg/ml, 3mg/ml, 5mg/ml
○1mlを量りとり精製水を加え100mlとする(100倍希釈)
 →濃度は0mg/ml, 0.01mg/ml, 0.03mg/ml, 0.05mg/ml
 →μgに換算すると0μg/ml, 10μg/ml, 30μg/ml, 50μg/ml

2.計算した濃度(μg/ml)を横軸xに、HPLCで得られた面積の値を縦軸yにしてグラフを描きます(エクセルならば散布図ですね)。
この時、0μg/mlの試料を分析したときの値も使いましょう(ピークが出ないのならば、面積は0とする)。

3.近似式を追加して検量線の式を計算させると、
   y = 54291x + 19103  R2 = 0.9997
となります。

4.これで検量線ができたので、未知試料を分析したときのピーク面積1738876をyの部分に代入して計算します。

5.xの値として31.6769...(μg/ml)と出てきます。

6.この値はあくまでも"分析した試料"の濃度です。目的としている化粧品1mlを100mlに希釈したものがこの濃度であることから、化粧品中の濃度は100倍して約3158(μg/ml)となります。mgやgに換算しなおすと、それぞれ3.2mg/ml、0.0032g/mlとなります。

7.もし【化粧品"100ml"中に有効成分Aは何g含まれているか】ということならば、単純に濃度に100mlをかけて、0.32gとなります。
ここで注意が必要なのは、【化粧品"100g"中に有効成分Aは何g含まれているか】となっていることです。厳密には100mlと100gは同じ量を表していません。化粧品100mlの密度(g/ml)が分かればこの値を0.32にかければ【化粧品"100g"中に有効成分Aの量】が出せます。密度が不明なときは、例えば100mlを正確に量り取ってから、その質量を精密天秤で測ってください。質量÷体積で密度が計算できます。

ちょっと整理するために長くなりますが、順番に書きますね。

1.まず検量線に用いた標準溶液の濃度をきちんと計算しましょう。
○標品 0g、0.1g、0.3g、0.5g
 →mgに換算すると0mg, 100mg, 300mg 500mg
○全て精製水で正確に100mlとする
 →濃度は0mg/ml, 1mg/ml, 3mg/ml, 5mg/ml
○1mlを量りとり精製水を加え100mlとする(100倍希釈)
 →濃度は0mg/ml, 0.01mg/ml, 0.03mg/ml, 0.05mg/ml
 →μgに換算すると0μg/ml, 10μg/ml, 30μg/ml, 50μg/ml

2.計算した濃度(μg/ml)を横軸xに、HPLCで得られた面...続きを読む

QHPLCについて質問です

最近HPLCを使い始めたもので、勉強不足で申し訳ありません。
逆相のカラム(ODS)を用いて分離を行っているのですが、ターゲットとしている物質(疎水性が高い)のほかにピークが出ています。このピークは、1分半くらいに見られほとんど分離できていないようです。溶離液を水:アセトニトリル=1:1まで変えて極性をあげてみたのですが、このピークの保持時間はほとんど変化が見られませんでした。カラムはほかにシリカにオクチル基を結合したものしか所有しておりません。この早い保持時間にみられる物質を分離するいい方法はありませんか?溶離液の極性を上げすぎた場合、ターゲットの物質のほうが溶けきれなくなってカラムを駄目にすることなどあるのでしょうか?
また、分離の原理のところで疎水性相互作用で分離すると書いてある物と極性の差によって分離すると書いてあるものがあるのですが、極性が高い=親水性と理解してよろしいのでしょうか?
ながながとすみません。どうかよろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

ODSカラムは何本使ったか、もう記憶にありませんが、結構タフであったと思います。一度でだめになったことが一回だけありました。新品のカラムを溶離液に置換するとき流量をいきなり早め、ベースラインが安定せず、あきらめたことがありました。

一度、基本の説明をお読みすることをお勧めします。

カラムがだめになると、正常の一本のピークが分裂する現象や(これはもうだめ)、圧力が徐々に上昇していくので解ると思います(圧力あがってきたときは、よく80%のMeOHで洗浄していました。このとき、いっぱい詰まっていたのが出てきます)。

色々試すことで、LCは得意になっていきますよ。

QMeHOと水の共沸混合物

有機化学実験のてびき1を読んでいた所、
よく使われる有機溶媒の性質の欄に、
methanolは水と混ざるけれど共沸混合物を作らないとありました。
エバポレータを回した時に少し水分が残ったらMeOHを加えて飛ばしていたのですが、
本当に共沸混合物を作らないのでしょうか?

Aベストアンサー

共沸という用語は少々厄介です。
化学的には「液体の混合物が沸騰する際に液相と気相が同じ組成となる現象」ということであり、たとえばエタノール-水の系であれば約96:4の混合物がこれに該当します。
http://ja.wikipedia.org/wiki/%E3%83%8E%E3%83%BC%E3%83%88:%E5%85%B1%E6%B2%B8
http://www006.upp.so-net.ne.jp/h-fukui/86Azeotrop.htm

水-メタノールの混合物がこうした共沸混合物を形成するかどうかは不明ですが、おそらくそうはならないということでしょう。

ただし、現実にはこうした物理化学的に厳密な意味での共沸ではない意味で用いられることもあります。
No.1のご回答にありますように、メタノールを加えることによって、常圧で水が100℃よりも低い温度で気化するということはあるでしょう。しかし、それを厳密な意味での共沸と呼んでよいのかどうかは私には判断できません。単に、水の分圧が下がっているだけのことかもしれません。現実問題としてはそれでもかまわないでしょうね。

それと、水-エタノールの場合ですら、共沸混合物中の水が4%にしかならないということであれば、メタノールであれば、共沸したとしてもその割合ははるかに低くなると予想されます。あやふやな回答で申し訳ありませんが、水の割合が0に近いという意味で「共沸しない」と言われるのかもしれません。

共沸という用語は少々厄介です。
化学的には「液体の混合物が沸騰する際に液相と気相が同じ組成となる現象」ということであり、たとえばエタノール-水の系であれば約96:4の混合物がこれに該当します。
http://ja.wikipedia.org/wiki/%E3%83%8E%E3%83%BC%E3%83%88:%E5%85%B1%E6%B2%B8
http://www006.upp.so-net.ne.jp/h-fukui/86Azeotrop.htm

水-メタノールの混合物がこうした共沸混合物を形成するかどうかは不明ですが、おそらくそうはならないということでしょう。

ただし、現実にはこうした物理化学的...続きを読む

Qエクセル STDEVとSTDEVPの違い

エクセルの統計関数で標準偏差を求める時、STDEVとSTDEVPがあります。両者の違いが良くわかりません。
宜しかったら、恐縮ですが、以下の具体例で、『噛み砕いて』教えて下さい。
(例)
セルA1~A13に1~13の数字を入力、平均値=7、STDEVでは3.89444、STDEVPでは3.741657となります。
また、平均値7と各数字の差を取り、それを2乗し、総和を取る(182)、これをデータの個数13で割る(14)、この平方根を取ると3.741657となります。
では、STDEVとSTDEVPの違いは何なのでしょうか?統計のことは疎く、お手数ですが、サルにもわかるようご教授頂きたく、お願い致します。

Aベストアンサー

データが母集団そのものからとったか、標本データかで違います。また母集団そのものだったとしても(例えばクラス全員というような)、その背景にさらならる母集団(例えば学年全体)を想定して比較するような時もありますので、その場合は標本となります。
で標本データの時はSTDEVを使って、母集団の時はSTDEVPをつかうことになります。
公式の違いは分母がn-1(STDEV)かn(STDEVP)かの違いしかありません。まぁ感覚的に理解するなら、分母がn-1になるということはそれだけ結果が大きくなるわけで、つまりそれだけのりしろを多くもって推測に当たるというようなことになります。
AとBの違いがあるかないかという推測をする時、通常は標本同士の検証になるわけですので、偏差を余裕をもってわざとちょっと大きめに見るということで、それだけ確証の度合いを上げるというわけです。

QHPLCカラムの洗浄方法

逆相のカラムは使用後に必ず水で洗浄した上で、適当な水:溶媒系に置換するものだと思っていたのですが、今私が勤務しているところでは、誰も水で洗いません。ていうか、50%アセトニトリルを流すことを「洗浄」と称しています。実際、これでいいんですかね?

Aベストアンサー

#6です。お恥ずかしい限りです。
おっしゃる通り、「水:メタノール=9:1」の間違いです。別の分析条件でよく使っていたのでついつい・・・。

それから、#7さんの回答でもうひとつ思い出しました。どのようなバッファーだったかは忘れましたが、移動相をメンブランフィルターに通してからでないと使えないものがありました。

brassardさんの直面している条件で有効かどうかわかりませんが、予防の意味で一度試してみては?

既に同様の処置を済ませた上でのご質問でしたらご容赦下さい。

QHPLCでの内部標準とは

HPLCでの分析初心者です。
サンプル抽出時に、内部標準を加えることによって何が変わるのですか?基礎的なことだと思うのですが、難しくてよくわかりません。すみませんが、わかりやすく教えてください。

Aベストアンサー

Text 形式しか使えないので、ちょっと書きにくいんですが、その点は堪忍してください。

まず Recovery Rate (回収率) から説明したほうが、わかりやすいと思うのでそちらから。また一般論にすると、却ってややこしくなるかもしれないので、具体的な数値を使います。ご自分で一般化してください。

Matrix: Plasma 1 mL を使う
Analyte: Ci mg/mL
I.S.: S mg を 1 mL の Matrix に加える。

ここで、検量線は、0 から始まり、数 Points の濃度にしますね。これを処理して、最終的に HPLC に Load するために調製した溶液 (processed sample) を 200 microL にするとします。

I.S. が、100% 回収できたとすれば、processed sample 中の絶対量は、S mg/ 200 microL = 5S mg/mL になりますね。このうち 20 microL を HPLC に Load するとすれば、I.S. は、0.5S mg 入ることになります。これに対応する Response (Ri) が、観察される筈です。

実際には、抽出過程でのばらつきがあるため、観察される Response は、Sample により R'i のようにばらつくはずです。この R'i / Ri を絶対回収率 (Absolute Recovery) と言います。

同じように、検量線の場合は、加えた Ci は既知ですから、同じように Absolute Recovery を求めることができます。

次に、各 Sample 内での、Analyte と I.S. の関係を考えます。Matrix 中には
 Analyte Ci
 I.S. S
入っていますね。この両者の、抽出などの過程で生じる Absolute Recovery が、一定値 (多少のばらつきはありです) a だったとすれば、processed sample 中には、
 Analyte aCi
 I.S. aS
となるので、量は変化しますが、Analyte / I.S. の比は、一定になります。そこで、上げられた例のように、aS に由来する Response のばらつきは a に依存するので、Response がばらばらになることはありえます。ここで、Analyte の Absolute Recovery が、常に I.S. のそれに等しいのであれば、Analyte の Response も aCi になるので、Analyte / I.S. は、もともとの Matrix 中の比と同じになるので、検量線が、きれいに引けることになります。

これがまさに内標準法を採用する一つの目的です。検量線は、添加した濃度 (Concentration added) に対し、HPLC で得られる Analyte と Internal Standard の比 (Ratio of onserved Value) を回帰して、求めます。

これとは別に、絶対検量線法というのもあって、これは Analyte の Response そのものを回帰します。挙げられた例をこの方法で回帰したときには、ろくな検量線にはなりえませんね。これは Sample ごとの、Absolute Recovery のばらつきが大きいのです。このようなときにも、同じような Recovery を示す I.S. を用いることで、補正しているのです。


さて、もうひとつの方というのは、ここまでの話でお分かりのように、Analyte / I.S. が一定である、ことをまず証明、
 具体的にはある狭い範囲での直線性を確認します。
した後、単独の試料に一定量の I.S. を加え、分析。Response の比から、濃度を出してしまうものです。これは、単なる溶液になっているなど、Matrix が単純な場合用いる方法です。予想値が高い場合は、希釈する程度の操作で済むときに使います。実際の使用例は、動物に薬物を投与するときの溶液 (正式な用語は、被験物質調製混合物) の濃度検定 (きちんとした濃度でなければ投与量が計算できませんから)、被験物質調製混合物中の被験物質の安定性 (調製した後一定条件下で保存している間に壊れないかどうか) を調べるときに用いています。No. 2 が言われているのは、これに相当します。

参考に挙げたのは、FDA の正式 Document で英語ですが、実際にどういう目的で用い、どういう処理をするか、判定基準も含めて、きちんと記載しています。可能であれば、一度読んでみてください。検量線の処理方法などは、世界的に authorize されているのはこの文書だけです。

参考URL:http://www.fda.gov/cder/guidance/4252fnl.htm

Text 形式しか使えないので、ちょっと書きにくいんですが、その点は堪忍してください。

まず Recovery Rate (回収率) から説明したほうが、わかりやすいと思うのでそちらから。また一般論にすると、却ってややこしくなるかもしれないので、具体的な数値を使います。ご自分で一般化してください。

Matrix: Plasma 1 mL を使う
Analyte: Ci mg/mL
I.S.: S mg を 1 mL の Matrix に加える。

ここで、検量線は、0 から始まり、数 Points の濃度にしますね。これを処理して、最終的に HPLC に Load するため...続きを読む

Q統計学でいうRSD%とは何ですか。

統計学でいうRSD%の平易な説明と計算方法を知りたいのですが。標準偏差はわかります。

Aベストアンサー

RSD%とは、相対標準偏差をパーセントで表示したものと思われます。

相対標準偏差(%)=(標準偏差/平均値)×100

次のページは、「相対標準偏差 RSD 平均値」で検索して出たものの一つです。
http://www.technosaurus.co.jp/product/mlh_faq_sd1.htm

参考URL:http://www.technosaurus.co.jp/product/mlh_faq_sd1.htm


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