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先日PCR法を用いてDNAの複製を行ったのですが、電気泳動を行ってもバンドがまったく確認できませんでした。
原因としては唾の混入や皮膚の接触などが考えられたのですが、実のところ皮膚にはDNAを分解するだけの酵素が存在するのでしょうか??

また皆さんがPCR法を用いたときに経験した失敗などがありましたら教えてくださいm(__)m
よろしくお願いします。

A 回答 (1件)

>唾の混入や皮膚の接触



仮に起こったとしても、この程度の事でDNAを分解する事はできません。
酵素の失活や試薬の入れまちがいが原因ではないでしょうか。
基本的に、DNAの増幅はプライマーの設計とテンプレートによるコンタミしか気を付ける所はありません。
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QPCRの失敗について

PCR後電気泳動したんですが、
バンドが出てきません。
PCRって失敗することあるんですか?

単にプライマーとテンプレートを入れ間違えたんでしょうか?

テンプレートの前後にPCRによりタグ(Hisタグ、制限酵素サイト、転写促進配列など)を付けているのですが。

もし仮にテンプレートとプライマーが合っていない場合、テンプレートだけのバンドは出てきそうですが。
そうでもないんでしょうか?

Aベストアンサー

>PCRってちゃんと溶液を混ぜてもできないことあるん
>ですか。
もう決まった条件があるのならまずうまく行かないことはありません。ですから試薬やサンプルに問題がある可能性が大です。
ただし、ちがうPCRマシーンをつかうと条件が変わってくる可能性があるので出ない場合は再検討してみることも考えたほうがいいことがあります。同じメーカで同じモデルでも機械が違うと違うとおっしゃる方もいます。
あとうまくいった時に使用したのと同じ種類のポリメラーゼを使ってますよね。それも確認した方がいいかもしれません。逆手にとって、手元に違う種類の酵素があれば使ってみるのも手かもしれません。たまにメーカーが間違ったプライマーを送って来ることがあるという話も聞いたことがあります。本当かどうかよく分かりませんが、メーカーの人に確認してもらうというのも必要なのかもしれません。

Q電気泳動の失敗

はじめまして

電気泳動の失敗例を探しています。

自分のバンドが何故でなかったのか
調べてるのですが…
分子量マーカーはちゃんとでたので
ゲルの問題ではないと思います。

出たのは「靄」みたいなので…ーー;

実験は

アガルースゲルの大腸菌を制限酵素で切断
エチシウムブロマイドで色を着け(色ではありませんが)
UVで照射し撮影しました。

どなたがご存知の方
よろしくお願い致します。

Aベストアンサー

制限酵素のSTAR活性かもしれません。
STAR活性のある制限酵素(EcoRIなど)を過剰に加えたり、反応時間が長すぎたり(オーバーナイトなど)すると、認識部位以外でも切断が起こって、DNAが靄状(スメア)になります。
経験者。

Qプライマーダイマーが出てしまいます。

PCRがうまくいきません。プライマーダイマーが出てしまいます。
鋳型DNAが少ないとできやすいと聞いた事があるのですが、鋳型はあまり
たくさんないので、増やす事もままなりません。
他に何か良い方法があったら教えて下さい。

Taqポリメラーゼを使っています。Hot Startしてもダメでした。

例えば、プライマーを減らしたりするのは有効でしょうか??

Aベストアンサー

いちばん確実でシンプルな解決策は、プライマーを変更することだと思います。プライマーダイマーができてしまうということは、自分がデザインした2ヶのプライマーに、相補的な配列があるということです。アニールしてしまうのですから、温度や濃度などのファクターを変更しても、やはりアニールは起きてダイマーをつくりかねません。頑張っても徒労に終わる可能性があるので、相補的な部分をつくらないように、プライマー配列をデザインし直すのが早いと思います。

Q電気泳動でバンドが出ない理由(学生実験)

Transformationした大腸菌のプラスミドを抽出して、アガロースゲル電気泳動にかけてLigationなどがうまく行っているかどうかを確かめました。

大腸菌のコロニーに
TE/RNaseA

NaOH(アルカリ変性させた)

NaOAc(中性に戻した 大腸菌のゲノム:ニックが入ってもとに戻らない、プラスミド:元に戻る)

phenol/chlorophorm(ph層:大腸菌のゲノム  水層:プラスミドをふくむ)

水層をとりだしてisopropannol加える

ethanol(洗浄)
の順で操作を行った後、電気泳動しました。

しかし、私がやったサンプルはバンドがだいぶ薄くなってしいました。
その理由がわからず悩んでおります。

予想としては、phenol/chlorophormをいれて遠心をかけて油層と水層にわけたときに、二つの層の間に白い層(タンパク質が含まれているらしい層)があり、水層(プラスミド含)を取り出す際にそれをピペットで吸ってしまったことが原因だったのかな、と思っているのですが、その根拠などもわかりません。

どなたかわかる方がいらっしゃいましたら、教えてくださると幸いです。

Transformationした大腸菌のプラスミドを抽出して、アガロースゲル電気泳動にかけてLigationなどがうまく行っているかどうかを確かめました。

大腸菌のコロニーに
TE/RNaseA

NaOH(アルカリ変性させた)

NaOAc(中性に戻した 大腸菌のゲノム:ニックが入ってもとに戻らない、プラスミド:元に戻る)

phenol/chlorophorm(ph層:大腸菌のゲノム  水層:プラスミドをふくむ)

水層をとりだしてisopropannol加える

ethanol(洗浄)
の順で操作を行った後、電気泳動しました。

しかし...続きを読む

Aベストアンサー

バンドが薄くても検出されてるなら、学生実験ならまぁOKではないでしょうか。

 原因としては、エタノール沈澱洗浄の際、プラスミドまで吸ってしまったり、あるいはもともとサンプルに極端にプラスミドが少なかったりしたこと、あるいは上清分離の際にプラスミドあるいはゲノムの層を取る量が少なかったなどが挙げられるのではないでしょうか。

 あるいは電気泳動の際に、希釈でミスしてたりも考えられます。

 ご検証ください。

 

Q学生実験のPCRについて教えてください・・

私は化学系の学科に所属する大学生です。

生物化学の学生実験でPCRとゲル電気泳動を行ったんですが、課題の回答がわからず困ってます・・・
どなたか教えていただけませんか?

(1)検出された電気泳動のバンドに関して、25サイクルの時のODと30サイクルでなぜ違いがかなりあるのか?

(2)全くバンドが検出されないサンプルもあるが、それはなぜか?

(3)mRNAの発現を正確に行うのになぜPCRのサイクル数が重要なのか?

(4)電気泳動で検出されたバンドに関して、bpを解析する際にサイズマーカーの位置と比較する以外にどう考察・解析したらいいのか?

4つもあってすみません!生物系はほんとに苦手なんです・・
どれか1つでもいいので教えてください!
あとできれば考察の材料なんかも教えてもらえると嬉しいです・・

Aベストアンサー

(1)検出された電気泳動のバンドに関して、25サイクルの時のODと30サイクルでなぜ違いがかなりあるのか?

PCRの原理を見ると理論上2のn乗(n=サイクル数)で
PCR産物は増えていきます。
そのため25と30サイクルだと2の5乗の違いが出ます
ただ、実際やってみるとわかるのですが
鋳型量が多かったりするといち早く
PCRが限界量まで増えてしまうことがあります
それはPCRが進むことでdNTPやプライマーが
失われたり、酵素が失活するためです。
25サイクルよりも前にプラトーに達するようですと
25と30の間に差は大してなくなります。

(2)全くバンドが検出されないサンプルもあるが、それはなぜか?

一言で言うとPCRがうまくいっていない
ということですね。
プライマー設計が悪い。鋳型の状態が悪い
作業的なミス(入れ忘れなど)
Tm値などのプログラムミス
こういったところでしょうか

目的のものがあるか無いかという実験であれば無い

(3)mRNAの発現を正確に行うのになぜPCRのサイクル数が重要なのか?

mRNAの発現量を観察する場合は
ほとんどの場合、いったんcDNAに逆転写して
その後、そのRT-PCR産物を鋳型として
通常のPCRを行います。

肝心の目的物の量を測る方法はいくつかあるのですが
最も簡単なものはPCRがプラトーに達する前に
PCRを止め(20サイクル程度)電気泳動後
ゲル染色やサザンブロットによって
目的産物量を可視化、定量します。
mRNA量が多い=鋳型量が多い=同サイクル数なら
より強いシグナル
となるわけです。

もう一つの方法はリアルタイムPCRと呼ばれる方法で
検出試薬にサイバーグリーン(2本鎖のみが
検出される)を用いて1サイクル進むごとに
PCR産物量をシグナルから算出する方法です。
「ライトサイクラー」で検索すると
その機器がどういうものかわかると思います。
これを使って
「ある一定量にPCR産物が達するときのサイクル数」
を求めます。mRNA量が多い=鋳型が多い=より少ない
サイクル数で一定量に達する


(4)電気泳動で検出されたバンドに関して、bpを解析する際にサイズマーカーの位置と比較する以外にどう考察・解析したらいいのか?

目的のバンド以外があるのか無いかも重要です。
PCRの特異性は実験によっては非常に重要に
なるからです。

低分子側にもわっとしたシグナルが多いと
プライマー設計やPCR条件がゆるく、
プライマーダイマーができているとか
いうことも電気泳動像から見ることができますね

(1)検出された電気泳動のバンドに関して、25サイクルの時のODと30サイクルでなぜ違いがかなりあるのか?

PCRの原理を見ると理論上2のn乗(n=サイクル数)で
PCR産物は増えていきます。
そのため25と30サイクルだと2の5乗の違いが出ます
ただ、実際やってみるとわかるのですが
鋳型量が多かったりするといち早く
PCRが限界量まで増えてしまうことがあります
それはPCRが進むことでdNTPやプライマーが
失われたり、酵素が失活するためです。
25サイクルよりも前にプラトーに達するようですと
25と...続きを読む

Q電気泳動のスメアバンド

DNAを電気泳動をしたときに、バンドが一本ではなく、スメアになることがあると思います。スメアバンドは様々なサイズのDNAが存在するために、見かけ上スメアになると思っていたのですが、ほんとうのサイズより遥かに大きなサイズと思われるところまで、スメアなバンドが広がっていたりします。また、スメアなバンドをゲルから回収して再精製して泳動してみると、違ったサイズにでたりすることもあります。
スメアバンドの起こる原因やスメアバンドの正体、また、なにかスメアバンドについての情報など、ご教授よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

エチジウムブロマイドは二本鎖の核酸において塩基間にもぐりこむように結合します。そのため、2本鎖のRNA・DNAが染色されます。そのほかにはゴミとかとも結合したりしますがスメア状にはならず、ぽつぽつとした点状に光ります。
PCRにはdNTP・プライマー・テンプレート(DNAとRNA)・DNAポリメラーゼ・bufferが含まれており、反応後になると上記の残留物に加えて増幅産物が含まれるようになります。
この中での二本鎖の核酸成分は増幅産物・テンプレートDNA・テンプレート中のRNAが二本鎖を形成したもの、プライマー同士が反応したプライマーダマーです。RNAやプライマーダマーは一般的に低分子領域にスメアとして現れます。また、PCR反応液にテンプレートを入れすぎるとこれもまた電気泳動上に現れます。サンプルの状態によってはスメア状に出ることもあります。
それと私がキットといっているのはまさにそのフィルターのことです。おそらく、断片化するのは物理的な影響によるものと思いますが、詳しくは販売している会社に問い合わせてください。いろいろと製品ごとの特性がありそうですから。それと製品によって生成できるサイズが異なりますのでそちらは説明書を読んでください。私はキアゲン派でしたがそんなに大きなサイズのものは生成できなかったと思いますよ。

エチジウムブロマイドは二本鎖の核酸において塩基間にもぐりこむように結合します。そのため、2本鎖のRNA・DNAが染色されます。そのほかにはゴミとかとも結合したりしますがスメア状にはならず、ぽつぽつとした点状に光ります。
PCRにはdNTP・プライマー・テンプレート(DNAとRNA)・DNAポリメラーゼ・bufferが含まれており、反応後になると上記の残留物に加えて増幅産物が含まれるようになります。
この中での二本鎖の核酸成分は増幅産物・テンプレートDNA・テンプレート中のRNAが二本鎖を形成したもの、プライ...続きを読む

Qプラスミド精製の原理

大腸菌からプラスミドを取り出す(精製)の
原理を簡単にいうとどんな感じですか?

今はキアゲンのキットを使っているので
いまいち原理がつかめません。
塩化セシウム、ボイル法とかありますが、
教科書を読んでもいまいちピンきません。

簡単に教えていただけませんか。

Aベストアンサー

1.大腸菌のサスペンションにアルカリ溶液を入れる
(大腸菌の膜が壊れて、タンパクやDNAなどが出てくる。DNAはアルカリで変性して一本鎖になる)

2.酸で中和する
(変性したタンパクなどは析出、長いゲノムDNAは中和で二本鎖に戻ろうするが、長いので絡まって析出。プラスミドDNAは小さいので二本鎖に戻って溶液中に存在)

3.遠心分離して上澄みを回収
(タンパクや絡まったゲノムDNAなどは沈殿、上澄みにあるプラスミドDNAを回収)

4.昔は(10年前の記憶だと)、フェノール・クロロホルムで、残りのタンパク質・脂質などを除く。
(脂質はフェノール層へ、DNA・RNAは水層へ、タンパク質は中間層へ分離するので、水層を回収)

5.その後、イソプロパノールでDNA・RNAを沈殿させる。(イソプロパノールでDNAの水和水が取られて、DNAが不溶化して沈殿する)

6・RNA分解酵素でRNAを分解して、もう一度フェノール抽出をして、エタ沈(イソプロと同じ原理)して、その沈殿を回収するとプラスミドDNAが得られる。

キアゲンは、4のところで、カラムにかけると、DNAが樹脂に結合するので、bufferで不要なものを洗い流して、最後にpHを変えると、プラスミドDNAは溶出されてきます。キアゲンのホームページからマニュアルをダウンロードすれば、詳しく書いてありますよ。

1.大腸菌のサスペンションにアルカリ溶液を入れる
(大腸菌の膜が壊れて、タンパクやDNAなどが出てくる。DNAはアルカリで変性して一本鎖になる)

2.酸で中和する
(変性したタンパクなどは析出、長いゲノムDNAは中和で二本鎖に戻ろうするが、長いので絡まって析出。プラスミドDNAは小さいので二本鎖に戻って溶液中に存在)

3.遠心分離して上澄みを回収
(タンパクや絡まったゲノムDNAなどは沈殿、上澄みにあるプラスミドDNAを回収)

4.昔は(10年前の記憶だと)、フェノール・クロロホルム...続きを読む

Q電気泳動の原理について

今大学で電気泳動を盛んにしているのですが、いまさらながら電気泳動の原理や、なぜしているのかなどがいまいちよくわかりません・・・バンドがでてきますが、何を表しているのかもいまいちです。。情けない限りなのですが、どなたか教えていただけるとありがたいです。染色体地図をかいてくるとういう課題もでているのですが、電気泳動の意味がよくわかっていない自分には手のつけようのない課題なのです。どうかお願いします。

Aベストアンサー

DNAの電気泳動の目的は簡単に言うと、さまざまな大きさの断片をその大きさによって分離することです。
すなわち、泳動後に現れるバンドは、大きさのまとまった断片の集まりということになります。

まず、DNAは核酸という酸であるということはご存知のことと思います。
酸は水溶液中でマイナスに帯電します。
つまり、電気を流すとプラスの方へ流れていくことになります。
DNAを流すゲルは肉眼では見えないほど細かい網目構造となっているので、より小さな断片ほどその網目構造を素早く縫って移動できます。
これは、よりプラス極の近くに現れるバンドほど小さな断片であることを意味します。

以上のことをまとめるとどうでしょう?電気泳動の全体像が見えてきませんか?

Q形質転換効率?の求め方

プラスミドの導入による細菌の形質転換のレポート作成中です。
形質転換効率(cfu/μg)求める式、どなたか教えていただけませんでしょうか??
また、プラスミドによる薬剤耐性化が問題となっている細菌感染症の例には、どのようなものがありますか??レポの提出日、明日なので、誰か助けてください><よろしくおねがいしますmm

Aベストアンサー

形質転換効率の意味を理解していれば、単純な割り算、掛け算です。特に公式のようなものはありません。
パラメータは
A. コロニーの数(プレーティングするを振っていたなら、数十から数百コロニーまいたプレートを採用します。少なすぎるとサンプリングによる振れが大きくなりますし、数えるのが不正確になります。同じ量をまいたプレートが複数ある場合は平均します)。

B. Aを与えたプレーティング細胞の体積
C. プレーティング細胞全体の体積(回復培養のため加えたSOC培地の体積でよろしい)
D. 使用したプラスミドベクターの重量(ライゲーション産物の場合はベクターの重量のみで、インサートは勘定にいれない)

計算例)
A=150 cfu, B=100 uL, C=1000 uL, D=1 ngとしましょう。

まいた100 uL中に含まれるプラスミド量は
1 ng x 100 uL/1000 uL=0.1 ng

そのプラスミド量で150個のコロニーが出たので、1 ugあたりに換算すると

150 cfu x 1 ug/0.1 ng= 150 cfu x 1 ug/0.0001 ug=1.5x10^6 cfu/ug

となります。単位につくmicro (uであらわしています), nano (n), pico (p)が順に1/1000ずつ小さいことをあらわすのは説明不用ですね。

薬剤耐性化の設問は、日常生活とのかかわりを問うているもので、専門知識よりむしろ新聞の社会欄に出てるような話題を求めているのではないですか。たとえば、院内感染で騒がれているのはどのような感染症でしょう。

形質転換効率の意味を理解していれば、単純な割り算、掛け算です。特に公式のようなものはありません。
パラメータは
A. コロニーの数(プレーティングするを振っていたなら、数十から数百コロニーまいたプレートを採用します。少なすぎるとサンプリングによる振れが大きくなりますし、数えるのが不正確になります。同じ量をまいたプレートが複数ある場合は平均します)。

B. Aを与えたプレーティング細胞の体積
C. プレーティング細胞全体の体積(回復培養のため加えたSOC培地の体積でよろしい)
D. 使用...続きを読む

Qアガロースゲル電気泳動におけるPCR産物バンドの乱れ

 600 bpくらいのDNA配列をPCRで増やし、その産物をPEG沈して精製しているのですが、PCR直後の電気泳動(1.5% TBE gel)では1本のバンドなのですが、PEG沈後の電気泳動では2本になっています。
 分子量で見ると、産物のバンド(600 bp)に加えて、450bp程度のバンドが新たに出現します。精製中に分解したのでしょうか?(でも、DNaseのコンタミだったらもっとズタズタに切れますよね)。それとも、精製過程で産物の一部が何か高次構造のようなものをとって、電気泳動上で二本になって見えるのでしょうか?
 原因についてご存知の方、あるいは同じ経験をされた方、教えてください。

Aベストアンサー

kohitsujikaiさん、こんにちは。

kohitsujikaiさんは、gel厚、緩衝液の量に気を使っておられるのでしょうか?

想像するに以下の条件で泳動していませんか?
泳動槽:サブマリン型
ゲル厚:4mm以上(結構厚めに作成)
緩衝液量:ゲルが沈むくらい(タプタプ?)
染色:後染めで30-60min程

もし、以上の条件で泳動されているならゲルの上面と下面で泳動に差が生じていることが考えられます。
(側面から見るとバンドが斜めになっていて、染色液の浸透が不十分なためバンドの上面側と下面側が染まっている状態です。このため上方から見ると2本のバンドに見える。)

今度、泳動・染色を行ったとき泳動方向にゲルを切断し、側面から観察してみてください。


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