in situ disrupyionとは何の目的のために用いる方法のでしょう?

私の読んだ論文には未知のDNAに既知のDNAを組み入れ、それをプローブに
してサザンをしたと書いてあったのですが、サザンが目的の技術なので
しょうか?また、この技術は酵母を用いた実験では一般的なのでしょうか?

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A 回答 (1件)

少し補足していただかないと私には正確な答えができませんが、おそらく、「未知のDNAに既知のDNAを組み入れ」ることで、遺伝子破壊を行っているように思います。

だとすると、サザンはその確認を行っているのでしょう。

論文の情報(雑誌名、巻、頁)を教えていただけば、たぶん正確に答えられると思います。
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Qin situ のプローブについて

antisense probeと sense probeはどのように区別されるのでしょうか?
例えば、T7プロモーターの下流に遺伝子配列が組み込まれている場合、T7 RNA polymeraseでは、どちらのプローブが合成されるのでしょうか?

Aベストアンサー

anti-sense probeは、mRNAの相補配列でmRNAと二重鎖を形成できます。
sense probeは、mRNAと同じ配列ですのでmRNAと二重鎖を形成することが
できません。

T7プロモータの下流に遺伝子が正方向に組み込まれていれば、
T7 RNA polymeraseでmRNAと同じ配列が転写されますから、
sense probeが合成されるということになります。

T7 RNA polymeraseでanti-sense probeを合成したければ、
遺伝子を逆方向に組み込む必要があります。

ちなみにですが、
元々anti-senseとsenseは、DNAの二本鎖を区別する名称で、sense鎖(+鎖)は、
TをUに変換するとコドンの並び(=mRNA配列)になるので、「意味のある配列」
と言う意味で命名されたものです。

QDNAプローブの長さとは?

ヒトゲノム中(30億bp)でランダム配列と仮定した場合、ある特定の配列(長さn塩基)が2度出現する確率が100分の1以下になるには

n≧□塩基

このようなほぼ確率の問題なのですが、nが何塩基以上でこの確率の条件を満たすのか求める問題です。

式などを含めた求め方が、わかる方がいましたら教えてください。

(ちなみに答えは16or17塩基程度になるそうです)

Aベストアンサー

”ある特定の配列”がポイントですが、適当に選んだ任意の配列という意味で考えてみましょう。
 
 確率=4^(-n)=pとして, 試行回数=3.0x10^9=N (厳密には、1塩基づつずらしていくと、n-1だけ短くなりますが、nは高々2桁程度の数値なので無視しましょう)とします。
 この条件で、ある特定の配列が、Nの試行で2回(丁度2回ですよ)出てくる確率Pは、
  P=NC2*p^2*(1-p)^(N-2) になります。
ただし、NC2はNこから2個とる組合せの数(NC2=N(N-1)/2)です。
つまり、N本のくじから、2本があたりで、残りN-2本がはずれである確率を求めるわけです。
これで、計算してごらんなさい。

QDNAプローブの作り方

初めてサザン法を行い、またそれに使うDNAプローブをPCR産物から作るのですが、疑問があります。

(1)DNAを一本鎖にするために、熱変性し、キットを用いて標識するのは分かるのですが、それを氷上において一本鎖に保ちます。それを、ブロッティングしたメンブランにアプライするわけですが、いくら一本鎖にしたといえ、プローブ同士が二本鎖になることはないのでしょうか?

(2)上記のようにPCR産物から作成したプローブはセンス鎖もアンチセンス鎖も混ざっているというわけですよね?

(3)泳動した二本鎖DNAのゲルをアルカリ変性させ一本鎖にしますが、これをメンブランに移したということは同程度のバンドの位置に解離した二本鎖があるわけで、そこにプローブ(アンチセンス鎖もセンス鎖も含む)をアプライしたらバンドは二本観察されるのではないのでしょうか?

初心者的な質問で恐縮ですがよろしくお願いします。

Aベストアンサー

(1) 標識時の反応溶液には濃厚なDNAが存在しますが、それをハイブリダイゼーションの溶液に投入した時点で希釈され、互いに2本鎖を形成する確率は激減します。とはいえ一部は互いに2本鎖を形成しますが、それ以外の一定量の分子が標的にハイブリダイズすれば問題は無いわけです。

(2) 標識のストラテジーによって片方の鎖だけが標識される場合もあり、両方の鎖が標識される場合もあります。

(3) アルカリ変性によって2本鎖DNAが2本の独立した1本鎖DNAになり、それに伴って物理的に両者が離れ得ることは確かですが、その離れ方に方向性はありません。バンドの分離というよりは分子の受動的な拡散と捉えるべきでしょう、どちらにせよゲルに各種処理を施すことによるバンドの拡散(ぼやけること)の程度と比べれば完全に無視できます。つまりバンドは2本になりません。

QDNAプローブの作製法

FISHに使用するDNAプローブを作製するとき、DNAサンプルのインサートはベクターから切り離した方が良いのでしょうか?インサートは2kbpほどです。また、インサートを切り離す場合、制限酵素で切断した後どのような作業をすればよいのでしょうか?または制限酵素で切断してすぐにラベリングしても大丈夫なのでしょうか?本を見ても書いてないので困っています。

Aベストアンサー

> 本を見ても書いてない

 そんなことは到底考えられません。
 人工的な DNA の合成方法や「切り張り」の手順に関しては、論文の materials and methods の項目にせよ、市販されている成書にせよ、いろいろなものに書いてあります。
 落ち着いて、良くお探しになって下さい。

 とりあえず、やっつけ調べの Google 検索で以下の pdf 書類を見つけました。
 手がかりにでもなれば幸いです。
http://www.dojindo.co.jp/wwwroot/productsj/info2/protocol/p12.pdf

Qin situ hybridizationのFISHはなぜDNA?

分子生物学の初心者です。
ISHこれからやろうと思っているのですが、なぜFISHはDNA推奨なのでしょうか?
またFISHでもRNAで行うことは可能なのでしょうか?

よろしくお願いします。

Aベストアンサー

>またFISHでもRNAで行うことは可能なのでしょうか?
プローブを直接蛍光ラベルして組織中のRNAに対するISHをやっている例は知りません。RNAは高々数kb、それをそれより短いプローブで検出するのですから、ターゲットあたりの標識数は限られますので、おそらく検出感度が不足です。少ない標識を酵素反応で増幅する必要があります。

旧アマシャムだったかで、プローブをFITCラベルしてアルカリフォスファターゼ (AP)標識抗FITC抗体で検出するシステムがありました。FITCのみだとプローブの合成効率を推定する程度の感度しかなく、本番の検出は酵素反応で増幅したシグナルを見なければなりませんでした。

AP標識を蛍光で検出するためのAP基質(HNPP)がロシュから出ています。蛍光検出したいのであればそれを使うと良いでしょう。

>なぜFISHはDNA推奨なのでしょうか?

DNAといっても染色体上の1コピーを検出するわけですね。
この場合、コスミドなどの巨大なプローブを使えば、標識数は稼げますから、酵素による増幅なしで直接蛍光標識を検出することも不可能ではありません。また、高倍率で観察して、染色体上という微細な構造上の一点のシグナルを検出するので、蛍光標識はそれほどたくさん必要というわけでもないのでしょう。

ピンポイントのマッピングを目的としているような場合、酵素で増幅してしまうと解像度が落ちてうまくない場合もあるでしょう。

>またFISHでもRNAで行うことは可能なのでしょうか?
プローブを直接蛍光ラベルして組織中のRNAに対するISHをやっている例は知りません。RNAは高々数kb、それをそれより短いプローブで検出するのですから、ターゲットあたりの標識数は限られますので、おそらく検出感度が不足です。少ない標識を酵素反応で増幅する必要があります。

旧アマシャムだったかで、プローブをFITCラベルしてアルカリフォスファターゼ (AP)標識抗FITC抗体で検出するシステムがありました。FITCのみだとプローブの合成効率を推定する程...続きを読む


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