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total RNAを組織から抽出し、RNase-free水に溶解し、-80度で保存しています。今後、このRNAを使って実験をしようと思っているのですが、、、RNAがどれくらい温度に対して安定なのか心配しています。というのも、今後、実験のたびにRNAを冷凍庫から取り出し、必要な分量を分抽した後、再び冷凍庫へ返すといったことを繰り返すからです。RNAにお詳しい方がいらっしゃいましたら、(1)RNAの熱安定性について(2)一般的なRNAの保存法とその注意点(3)冷凍→分抽→冷凍の繰り返し作業についての意見およびより良い方法、の3点について教えていただけないでしょうか?よろしくお願いします。

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A 回答 (2件)

ボイルするとか、オートクレーブするとかめちゃくちゃな加熱でなければ、RNAが特に熱に弱いということはないと思います。

ただし、RNaseのコンタミや過剰の水酸化物イオン、水素イオンがある場合(つまり適当なバッファリングをしていない場合)、温度が高いと加水分解を促進してしまうでしょう。

水溶液をディープフリーザで凍結保存している限り安定なはずですが、凍結融解を繰り返すのは確実に分解が進みますから(いろいろな要因があるでしょうが、一つには氷の結晶が生じるときに高分子に剪断力がかかる)1回分から数回分の使用量で小分けにしましょう。

しばらくむかしは、RNA水溶液に対して3倍量のEtOHを加えて-20℃、あるいは-80℃で保存するのが一番安心だといわれていました。このRNAのアルコール溶液を必要量とって、塩を加えEtOH沈殿してサンプルとしました。

現在のトレンドは、RNAを脱イオンしたフォルムアミドに溶解して-20℃で保存する方法です。フォルムアミドでRNAが安定化され、凍結しないのでハンドリングが容易、多くの目的ではフォルムアミド溶液そのままで使用できます。必要な場合はEtOH沈殿で溶媒交換します。
参考文献↓
http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.f …
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(1) RNAの熱安定性について詳細な情報は持ち合わせていませんが、


例えばRNAを化学的に分解する際には、
pHを9にして60℃で数分~数十分加熱する処理を行います。
ですから通常の溶解状態では、熱安定性は気にする必要はありません。

(2) RNAaseやバクテリアのコンタミが最も恐ろしいので、とにかく分注して保存します。
冷凍保存しますが、凍結融解の際に物理的な切断が起こり得ますので、
これを避けるため50%EtOH溶液として-30℃程度で保存、
あるいEtOH沈殿の状態で-80℃で保存します。
お持ちのRNAの量によりますが、-30℃と-80℃に数本ずつストックされると良いと思います。

(3) 日常的には-30℃のストックを使用します。
それが尽きたら-80℃のストックを50%EtOH溶液に調製し直して同様に使用します。
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QRNAの電気泳動について

RNAの電気泳動について

初歩的な質問で申し訳ありません。

最近、動物細胞からtotal RNAを抽出する実験を始めました。
抽出後、電気泳動でチェックを行っています。
泳動後は、28S rRNAと18S rRNAのバンドを確認し、
実験が成功しているか判断する・・・というところまで調べたのですが、
28Sと18Sはおおよそ何bp付近にバンドが現れるものなのでしょうか。

現段階では、バンドは1500 bp付近に濃くと700 bp付近に現れています。
また、2000 bpの上あたりにも薄くバンドが現れています。
28Sと18S rRNAの質量比が約2:1ということなので、
1500 bp付近と700 bp付近のバンドを確認すれば良いのかと
考えてはいるのですが・・・

同じような質問がすでにあったら申し訳ありません。
行き詰ってしまっています。

宜しくお願いします。

Aベストアンサー

そもそも、RNAは一本鎖ですので、
DNAマーカーのどの分子量のバンドと同じか?と言われると
実際に比較してみないとわからないです。

また、RNAの分子量は、RNAの電気泳動をホルムアミドやホルマリンを加えた変性条件でする場合と
普通のDNAを泳動する場合と同じ条件でする場合とでも異なります。

さて、質問者さんの文脈から察するに、
おそらく、抽出したRNAがちゃんとしたものか?(分解していないか?等)ということを
実験前に確認したいということと思われるので、そのことについてアドバイス致します。

http://www.funakoshi.co.jp/shiyaku/entry/856.php?mode=print

こちらのサイトの泳動像をご覧下さい。
total RNAを泳動した場合、ほとんど2本しかバンドとして確認することができません。
(泳動像の分子量が小さいところにうっすらバンドが見える場合も、その場合3本)

そのメインの2本が28S rRNAと18S rRNAです。

なので、そのメインに見える2本がきちんとバンドとして確認されれば(ほぼ2対1になるのはおっしゃる通り)、
そのRNAはちゃんと精製できていると判断していいと思います。

そもそも、RNAは一本鎖ですので、
DNAマーカーのどの分子量のバンドと同じか?と言われると
実際に比較してみないとわからないです。

また、RNAの分子量は、RNAの電気泳動をホルムアミドやホルマリンを加えた変性条件でする場合と
普通のDNAを泳動する場合と同じ条件でする場合とでも異なります。

さて、質問者さんの文脈から察するに、
おそらく、抽出したRNAがちゃんとしたものか?(分解していないか?等)ということを
実験前に確認したいということと思われるので、そのことについてアドバイス致します。

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QRNAとcDNAの安定性

基本的な事で本当にすいません。

RNAを抽出した後、逆転写酵素を使ってcDNAを作った際に言われた事なのですが、
「RNAはすぐに分解されやすいのですぐに凍結保存すること」
「cDNAは安定なので多少室温においていても全然大丈夫」

いずれも構造上は一本鎖なので安定性は同じように思えるのですが、この違いは何なのでしょう??同じRNAからコピーして作られたものだからほとんど同じような構造しているはずですよね?
ちなみに同じ様な質問になってしまうのかもしれませんが、RNaseでcDNAは分解されず、DNaseで分解されるのもなぜなのか???です。

教えて下さい。宜しくお願い致します。

Aベストアンサー

まず、一本鎖と二重鎖の違いがあります。
一本鎖では塩基対を作る部分で水素結合ができないので(分子内や分子間で部分的に対合ができることがあったとしても)チャージが裸のまま残ります。
チャージをもつ原子団は求核試薬、求電子試薬としてはたらき、共有結合をアタックしたり、水分子からアタックを受けたりします。
一本鎖DNAもRNAほどではないにしても、二重鎖にくらべ非常に不安定です。

もうひとつは、おそらくデオキシリボースの-Hに対し、リボースの-OHはチャージを生じるので同じように求核試薬、求電子試薬として働くからではないでしょうか。

もちろん、生体内や生体から抽出された核酸は分解酵素によって盛んに分解されます。
なかでもRNaseは活性が高く失活もしにくいので、実験中のRNAの分解をさけるために、これをいかにして除くかということにとくに神経を使います。

一方、生体内ではDNAは遺伝情報を保持するものですから、そうそう簡単に分解されては困ります。それに対して、RNAは必要なときに存在して、用がなくなったらとっととなくなってくれないと困りますので、RNAは不安定な方が合目的的です。

実際、原核生物ではRNAの寿命は非常に短く、転写のレベルでダイレクトに発現量を調節しています。

真核生物は、非翻訳領域やpolyA tailでRNAの寿命が調節されているほか、転写後調節の仕組みがあるので、もうちょっと複雑ですね。

まず、一本鎖と二重鎖の違いがあります。
一本鎖では塩基対を作る部分で水素結合ができないので(分子内や分子間で部分的に対合ができることがあったとしても)チャージが裸のまま残ります。
チャージをもつ原子団は求核試薬、求電子試薬としてはたらき、共有結合をアタックしたり、水分子からアタックを受けたりします。
一本鎖DNAもRNAほどではないにしても、二重鎖にくらべ非常に不安定です。

もうひとつは、おそらくデオキシリボースの-Hに対し、リボースの-OHはチャージを生じるので同じように求核試薬...続きを読む

QRNA抽出について

私は長年タンパク質専門で研究を行ってきたため、分子生物学は学生時以来なので大変困っております。
ラットの凍結組織(肝臓)からRNA抽出を行いましたが、うまくいきません。とは言え、同時に10本行ったらうち4~5本はOK、4本行ったら2本OK、と言った具合でいくつかは成功します。
キットはQIAGENのRNeasyPlusを使用し、凍結組織20~30mgに対し抽出液を600μl入れてポリトロンでホモジナイズし、gDNA eliminatorカラムも使用しています。中に入っているプロトコル通りであることも確認しました。組織の保存状態は悪くないです。うんと古いというわけでもありません。
研究室の人間に聞いても満足な返事が返って来ないので、こちらで質問させていただきました。経験がある方、アドバイス宜しくお願い致します。

Aベストアンサー

質問者さんは組織の保存状態についてわざわざ言及されているので、
その点は問題ないとして書き込ませていただきます。

私の感覚ですが、RNA抽出の過程にはものすごく強いタンパク質変性剤を使用しますので、
そのタンパク質変性剤の存在下では、まずRNAが分解されることはありません。
しかし、最終的にはタンパク質変性剤が存在しない溶液にRNAは溶けている状態になるので、
そのときに、それまでに取り除けなかったRNaseの活性復活、
もしくはその最後の溶液にRNaseがコンタミしていると最悪の結果になります。

それで私だったらまず疑うのは、最終的に溶かす水です。
これには少量でもコンタミするとRNAは壊れてしまうと思います。
もしそれを確認するのであれば、既に抽出されたRNAを質問者さんが使っている水で溶かして37℃で30分くらいおいた後、
電気泳動するとわかると思います。
この方法で使われている試薬等をチェックすると犯人がわかるときがあります。
ですが、タンパク質変性剤に含まれている場合はわからないかもしれません。

次に疑うのは、組織の量です。
確かにキット等では上限が記されているとは思いますが、試薬に少量コンタミしたRNaseより、最も多くのRNaseは組織由来のものであると私は思います。
多すぎるRNaseは最終的に残る可能性を大きくしてしまうと思います。
ちょっと組織の量を控えめにしてみてはいかがでしょうか。

あと、質問者さんが取ったRNAを泳動した場合、失敗と思われるものは全く何も泳動していないように見えるのでしょうか?
それとも、これが分解産物だろうなぁというスメアっぽいのも見えないのでしょうか?
もし、スメアも何も見えないというのならば、抽出行程のかなり初期の段階で壊れているか、
単に回収がうまくいっていないためであると考えられます。

回収については実際見ていないので何ともいません。
しかし、初期の段階で分解されるというのならば、やはり試薬のRNaseのコンタミをチェックするのがはやいかもしれません。
RNAがとれたりとれなかったりするのは、RNaseのコンタミが、なんと言うか、
うまくいくかいかないかのギリギリのところをさまようようなコンタミ具合で、
うまい人はいけるけどそうでない人は時々壊れるといったことなのかもしれません。
後はもう1つは、うまくいっている人と質問者さんが同時に同じサンプルでやることですかねぇ・・・。

乱文にて失礼します。

質問者さんは組織の保存状態についてわざわざ言及されているので、
その点は問題ないとして書き込ませていただきます。

私の感覚ですが、RNA抽出の過程にはものすごく強いタンパク質変性剤を使用しますので、
そのタンパク質変性剤の存在下では、まずRNAが分解されることはありません。
しかし、最終的にはタンパク質変性剤が存在しない溶液にRNAは溶けている状態になるので、
そのときに、それまでに取り除けなかったRNaseの活性復活、
もしくはその最後の溶液にRNaseがコンタミしていると最悪の結果にな...続きを読む

Q脱イオン水、MilliQ、蒸留水 の違いを教えて下さい

こんにちは。お世話になります。

バイオ、生化学系の実験に従事しているものですが「水」について教えて下さい。

水道水、脱イオン水、MilliQ、蒸留水(二段蒸留水)、超純水の違いを教えて下さい。
お互いの関係などありましたら(○○を~すると△△になる等)教えていただけると
わかりやすいかもしれません。

また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?

よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は除けません。

蒸留法は水を蒸留することで不純物を除く方法です。イオン交換法と組み合わせて2回蒸留することが一般的です。一般的な2次蒸留水の比抵抗は数MΩ・cmでバイオ・生化学関係には十分な純度です。動物培養細胞にも使用可能です。エンドトキシンも完全にフリーとまではいかないけれどもある程度の除去はできています。蒸留法は多くの不純物を除去可能ですが100度付近の沸点を持つ物質は除けません。

逆浸透法は半透膜に圧力をかけて精製する方法です。

限外濾過法は限外濾過膜を通す方法です。孔径は半透膜が数十nmに対し、限外濾過膜は数nmです。それゆえ、数kDa以上の分子であれば、限外濾過法で除けますので、エンドトキシンやRNaseなども除去できます。本当にエンドトキシンフリーな水が必要でしたら限外濾過法を行った水が必須です。ただ、普通のCOSとかHEKとかの動物細胞培養でしたら2次蒸留水でも十分です。蛍光検出用のマイクロアレイなんかは限外濾過水が必須なようです。

超純水は十数MΩ・cmの水のことです。MilliQはミリポア社の超純水装置を用いて作った水で比抵抗は15MΩ・cm以上と高純度の水です。MilliQに関してはイオン交換樹脂を通し、逆浸透法、限外濾過法を用いて精製しているようです。

>また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
これに関しては上で書いたように限外濾過膜で精製した水です。MilliQが当てはまるでしょう。(超純水も一般的には限外濾過をしているのでこれも当てはまりますかね。)

>動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?
これは、2次蒸留水以上の純度があれば十分です。2次蒸留水、MilliQ水、超純水が使用できます。

ただ、水関係の装置は日頃のメンテナンスが重要でイオン交換樹脂とか水を貯めるタンク、蛇口に汚染がないかは確認する必要があります。

実験書には必ずはじめのほうに書いてあることですので、pinokoBBさん自身でなにか実験書をご参照ください。

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は...続きを読む

Qエタノール沈殿での70%エタノールと100%エタノールの使い分け

エタノール沈殿をする際に、「70%エタノール」と「100%エタノール」を使用しますが、どうしてこの2種類の違う濃度のエタノールを使用するのか単純に疑問に思っています。
別に70%エタノールで洗浄して、もう一度70%エタノールで洗浄してもいいと思いますし、逆に両方とも100%エタノールでもいいのではないかと素人の私は思ってしまいます。
70%エタノールと100%エタノールを使い分ける意味を知っている方がおられましたら、お暇な時で結構ですので教えて頂ければ幸いです。
よろしくお願い致します。

Aベストアンサー

エタノール沈殿の原理は省いて簡単に書きます。

DNAが塩析してくる最適なエタノール濃度が70%ほどであるのです。
通常、100%エタノールをもとの液の2~2.5倍ほど加えると思います。
すると最終的にエタノールの濃度は70%ほどになるはずです。

このように最終的に70%ほどの濃度にする、ということが目的なので
最初に加えるエタノールは100%じゃないとかなり面倒なことになると思いませんか?

そして洗浄のときですが、70%エタノールではDNAは溶けません。
もちろん100%エタノールにも溶けません。

ですが、エタノール沈殿における「洗浄」というのは、余計な塩を取り除くということです。
塩は水に溶けますが、アルコールには溶けません。
なんで、洗浄の時に100%エタノールを使っても塩を溶かし込んで覗けないということになります。
70%エタノールの30%は水であるということが重要なのです。
30%の水に塩を溶かして洗浄すると想像してください。

簡単なエタノール沈殿ですが、それぞれに意味があり、かつよく考えれられてデザインさているのです。

そういうことをきちんと理解して実験することは重要だと思います。

エタノール沈殿の原理は省いて簡単に書きます。

DNAが塩析してくる最適なエタノール濃度が70%ほどであるのです。
通常、100%エタノールをもとの液の2~2.5倍ほど加えると思います。
すると最終的にエタノールの濃度は70%ほどになるはずです。

このように最終的に70%ほどの濃度にする、ということが目的なので
最初に加えるエタノールは100%じゃないとかなり面倒なことになると思いませんか?

そして洗浄のときですが、70%エタノールではDNAは溶けません。
もちろん100%エタノールにも溶けま...続きを読む

Qエクセル STDEVとSTDEVPの違い

エクセルの統計関数で標準偏差を求める時、STDEVとSTDEVPがあります。両者の違いが良くわかりません。
宜しかったら、恐縮ですが、以下の具体例で、『噛み砕いて』教えて下さい。
(例)
セルA1~A13に1~13の数字を入力、平均値=7、STDEVでは3.89444、STDEVPでは3.741657となります。
また、平均値7と各数字の差を取り、それを2乗し、総和を取る(182)、これをデータの個数13で割る(14)、この平方根を取ると3.741657となります。
では、STDEVとSTDEVPの違いは何なのでしょうか?統計のことは疎く、お手数ですが、サルにもわかるようご教授頂きたく、お願い致します。

Aベストアンサー

データが母集団そのものからとったか、標本データかで違います。また母集団そのものだったとしても(例えばクラス全員というような)、その背景にさらならる母集団(例えば学年全体)を想定して比較するような時もありますので、その場合は標本となります。
で標本データの時はSTDEVを使って、母集団の時はSTDEVPをつかうことになります。
公式の違いは分母がn-1(STDEV)かn(STDEVP)かの違いしかありません。まぁ感覚的に理解するなら、分母がn-1になるということはそれだけ結果が大きくなるわけで、つまりそれだけのりしろを多くもって推測に当たるというようなことになります。
AとBの違いがあるかないかという推測をする時、通常は標本同士の検証になるわけですので、偏差を余裕をもってわざとちょっと大きめに見るということで、それだけ確証の度合いを上げるというわけです。

QRNAの電気泳動

RNAの電気泳動についての質問です。
RNAをin vitroで作成し、できたRNAが目的の長さのものかどうか、スメアとなっていないか確かめるために行っています。マニュアルどおり(アガロースホルムアミド、サンプルにエチブロを混合)にやっているのですが、なかなかバンドが出てくれません。

(1)1レーンあたりサンプルRNAを2μg(吸光度より)流しているのですが、バンドが見えません。RNAだとDNAに比べてバンドが出にくいとかあるのでしょうか?5μg流したところでやっとバンドらしきものが見えました。
(2)さらに市販のRNAマーカーもバンドが出ません。マニュアルどおり1レーンあたり2μl使ってもバンドがなく、10μl使っても同様に見えませんでした。なにが悪いのでしょうか?RNaseには気をつけているつもりなのですが・・。マーカーが出ず、サンプルのサイズが不明なままなのです。なにか良い方法はないでしょうか?

DNAをメインに扱っていたもので疎い部分もありますが、よろしくお願い致します。

Aベストアンサー

>マニュアルどおり(アガロースホルムアミド、サンプルにエチブロを混合)にやっているのですが、なかなかバンドが出てくれません。

そういうマニュアルがあるのかしら。ホルムアミドではなくフォルムアルデヒドでは? EtBrを泳動バッファーとゲルに入れておくという方法はありますが、サンプルに混合というのもあまりスタンダードではないです。ErBrは核酸と逆方向に流れますから、泳動しているうちにどんどん離れていってしまいます。二本鎖だとインターカレートしたEtBrが多少は核酸といっしょに移動するでしょうが、変性状態のRNAではそれもほとんどないでしょう。

結論としては、泳動後のゲルをEtBr溶液中で染めるべきです。
検出感度は二本鎖(1バンド1ng前後)に比べ、RNAのような一本鎖では10倍くらい低いです。それもホルムアルデヒド存在下だとさらに低くなるので、場合によっては、ゲルを蒸留水などで何度か洗ってホルムアルデヒドを抜いてやる必要があります。

Qエタ沈後のペレットを確実に溶解させるには

プラスミドのTE(pH8)に対する溶解度は高いんですか?

エタ沈後、エタノールを除去するとプラスミドの沈殿が残りますが、
これをTEに溶かすことがあるんですが、どのようにして溶かしたら
いいんですか?
溶解度が高いんならほっとけばいいと思いますが。
エタ沈はWAKOのエタ沈メイトというキットを使っています。

また、大量のエタノールを入れて精製した場合、チューブの壁面に沈殿が付くと思いますが、沈殿後に加えるTEの液料が少ない場合は液に接しない壁面の沈殿はどうやって溶かせばいいですか?
ピペットで落とすしかないんでしょうか?

また、完全に溶解したかどうかはどうやったら確認できますか?
透明になっていれば溶解したということになるんでしょうが。
沈殿自体が見えにくいのでなかなか苦労しています。

Aベストアンサー

プラスミド自体の溶解度は悪くありません。
また、よっぽど大量でなければ、沈殿は透明でほとんど見えません。見えているとしたら不純物のためです。たまに、全然溶けない沈殿が残ることがありますが、プラスミド自体は上清にちゃんと溶けていています。

ただし、操作によって非常に溶けにくくなることがあります。
1.むかしは真空乾燥をするのが普通でしたが、これはDNAを溶けにくくさせるうえ、変性させるという報告もあるので、やめたほうが良いといわれています。実際、アイソトープラベルしたDNAを真空乾燥させると、溶液中に回収できずチューブに残る放射活性が非常に高いことがわかります。室温で放置、または37度くらいで穏やかに温めて乾燥させるのがいいです。

2.Mg++が存在するとDNAが非常に溶けにくい塩を作って溶けにくくなります(逆にこれを利用してEtOH沈殿の回収率を高める方法もあります)。これは純水に溶かそうとするときには難儀ですが、TEに溶かすのであればキレートされるのでそれほど問題ではありません。

沈殿を少量の溶媒に溶かすときには、タッピング(チューブの底をはじく)で、溶媒が十分な範囲をなめるようにすると良いでしょう。チューブの性質にもよりますが、沈殿が付いているところは、水はじきが悪くて液が残ります。壁に付いた液が軽くはじいただけできれいに取れるようになったら、溶けていると溶けたと思っていいでしょう。
また、おおよそ10 kb以下の小さなプラスミドならVortexを使ってもかまいません。

プラスミド自体の溶解度は悪くありません。
また、よっぽど大量でなければ、沈殿は透明でほとんど見えません。見えているとしたら不純物のためです。たまに、全然溶けない沈殿が残ることがありますが、プラスミド自体は上清にちゃんと溶けていています。

ただし、操作によって非常に溶けにくくなることがあります。
1.むかしは真空乾燥をするのが普通でしたが、これはDNAを溶けにくくさせるうえ、変性させるという報告もあるので、やめたほうが良いといわれています。実際、アイソトープラベルしたDNAを真...続きを読む

Q抽出DNAの保存

PCRに使用するため臓器から抽出したDNAを4℃で保存中ですが、保存期間はどのくらいまでが限界でしょうか?また、-20℃では保存期間はどのくらいですか?

Aベストアンサー

精製度によると思います。
簡易な方法で粗精製したものだと数週間から数ヶ月で明らかな分解が認められることがありますが(それでもPCRには使えるかもしれませんが)、超遠心法、フェノール抽出を慎重に行う、イオン交換カラムで精製などでnucleaseのコンタミを排除しておけば、数年単位の長期間にわたり4℃で分解なく保存できます。
私は最近、3年以上前にQiagenのDNaesyで精製してそのまま4℃で保存したゲノムDNAを使いましたが、電気泳動像に分解は認められずPCRの増幅も良好でした。

長期保存する場合、注意する点は、溶媒をTEにしておくこと(純水だとpHが酸性に偏るなどが原因で分解が起きやすくなる)、DNA濃度をあまり低くしないことです(たとえば数十ng/uL以上にする、水分子によるアタックを抑えるため)。

-20℃、-80℃などで凍結保存すれば、粗精製のDNAでも半永久的に保存できます。ただし凍結融解で物理的にせん断されてくるので、バックアップとして長期保存する場合はともかく、日常使うサンプルとしては避けたほうがいいでしょう。凍結を防ぐためにエタノールを加えてフリーザーに保存し、使うときになったらエタノール沈殿で回収するというのもいいでしょう。乾燥沈殿で保存するのは、確かに安定ですがゲノムDNAの場合再溶解が困難になるのでやめたほうがいいですね。

精製度によると思います。
簡易な方法で粗精製したものだと数週間から数ヶ月で明らかな分解が認められることがありますが(それでもPCRには使えるかもしれませんが)、超遠心法、フェノール抽出を慎重に行う、イオン交換カラムで精製などでnucleaseのコンタミを排除しておけば、数年単位の長期間にわたり4℃で分解なく保存できます。
私は最近、3年以上前にQiagenのDNaesyで精製してそのまま4℃で保存したゲノムDNAを使いましたが、電気泳動像に分解は認められずPCRの増幅も良好でした。

長期保存する場合、注...続きを読む

Qnanodropの測定精度について

いつも御世話になってます。

nanodropでDNA濃度を測定しているのですが、電気泳動での濃度と著しく一致しません。
nanodropでは1μg/μl以上の数値が出るのに、泳動してみると数百ngしか出てこないんです。
何度もやっているので、泳動の技術的な問題ではない気がするのですが。
nanodropは核酸を測るものなので、RNAが多いのかとも思ったのですが、泳動ではRNAはでてこないし、RNaseも添加しているためそうとは考えにくいのです。
また、通常DNAの260/280比は1.8くらいらしいのですが、私の場合では1.9代がほとんどで、260/230比も2.3付近と高い数値が出てしまいます。
どなたかご助言いただけたら幸いです。

Aベストアンサー

いろいろと考えられますが、
ゲノムDNAなど分子量の大きなもののコンタミがないものとして、
nanodropでの測定で時間がかかってませんか?
1μlを乗せてsample名などを入力して。。。で濃度がかなり上昇します。水分の蒸発が主な原因です。2ulほど乗せて数回すばやく計測してみて変化が無ければ、蒸発ではないと思います。あとよくあるのはATPやdNTPなどゲルに流してもわからない低分子量の核酸のコンタミです。


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