えーっと植物からのDNA抽出実験を行ったのですが
すりつぶした後にフェノール/クロロホルムを加え遠心分離しました。
すると3層に分かれたのです。
上層にはDNA、(RNAも?)、中間にできた膜にはタンパク質が、
そして下層(フェノール層)には
植物組織(細胞壁とか細胞膜)が溶けているのだとわかりました。
でもなぜこうなるのかわかりません。
簡単で結構ですので説明できる方教えてください。
またそれぞれの層にとけているもので他にもありましたらそれも教えてください

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A 回答 (5件)

少しだけヒントを、核酸、脂質の溶媒への溶解性、細胞壁の沈降係数、タンパク質の変性作用、を考えれば分かると思います。

ほとんど答えですが。
おまけですが、その後アルコール沈殿しましたよね。なぜ落ちるか?ブタノール濃縮というものもありますよね。
フェノ・クロにするのも理由があります。単独ではどうなってしまうのか?ヒントは親和性です。

それぞれの相に溶けているものですが、それぞれの物質の溶解度を考えれば分かります。生体内にある物であと多いのは、糖や塩ですがどこにいったのでしょう。
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この回答へのお礼

ありがとうございます。
核酸・脂質の溶媒の溶解性・親水性・疎水性などの性質には気付きましたが
沈降係数まで頭が回りませんでした。アドバイス(答え)ありがとうございました。
フェノ/クロを使うのとフェノ単独で用いる違いは水層中のフェノール量の違い。あとフェノ/クロはイソロイシンやロイシンを変性させる。
こんな感じでしょうか?

お礼日時:2001/01/29 22:57

フェノ・クロにする理由は半分あたってますね。

もう一つフェノール相に溶け込む水の量を減らすという理由があります。二つあわせて分離をよくするといわれます。またこれは経験上の話ですが、クロロヒォルムをいれることでタンパクがパック(固まる)ようなんですよ。タンパク量が多い場合には少しクロロホルムをおおめにいれます。

水相に残ったフェノを除去するために、クロロフォルム抽出しませんでした?
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この回答へのお礼

あっ 水相にとけこむフェノール量が減るだけではなく
逆もあるんですね。これもDNAの収率UPへ役立ちそうですね。
フェノの処理にはクロロホルム・イソアミルアルコールを使いました。
イソアミルは界面活性剤として働くので、懸濁状態をより長時間維持するのに
用いたようです。
経験上のお話はとても参考になりますし、覚えておきたいと思います。
今回は本当にありがとうございました。
ポイントを入れておきます。

お礼日時:2001/01/30 17:40

フェノ・クロにする理由は半分あたってますね。

もう一つフェノール相に溶け込む水の量を減らすという理由があります。二つあわせて分離をよくするといわれます。またこれは経験上の話ですが、フェノをいれることでタンパクがパック(固まる)ようなんですよ。タンパク量が多い場合には少しクロロホルムをおおめにいれます。

水相に残ったフェノを除去するために、クロロフォルム抽出しませんでした?
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 うる覚えですが、確か遠心分離てっのは、比重が大きかったり、分子量の大きさの順で分離するのであったようなきがしますが。


 DNAの遠心分離、よくやりましたよ。フェノールが手について真っ白になってああああてかんじの。
 あと溶けているものですが、下層には糖類が多いですね。塩類は分かりませんが昔のプロトコールには満遍なくあった気がしますが。(塩類は自信有りませんが、糖類はあります)
 
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この回答へのお礼

ありがとうございます。
もう一人の方の回答でもなんですが
比重とか分子量の大きさとかそういう物理的な面に
気付きませんでした。アドバイス&お答えありがとうございます。

お礼日時:2001/01/29 23:03

回答ではありません。

ヒントとして以下のURLへ

参考URL:http://page.freett.com/junw/MB/pureDNA/
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つまり、クロロホルム/メタノール2:1で不溶だったものを石油エーテルで抽出してしまったのです。

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タンパク質を溶液から抽出するための操作ですが、クロロフォルムの性質というより、有機溶媒(疎水性の溶媒)のタンパク質に対する一般的な性質です。

タンパク質は水溶液中で、親水基と水分子が引き合う(水和する)ことで水に溶け、水分子との相互作用が立体構造を保つのにも重要です。有機溶媒にさらされると、水和水が奪われます。また、通常なら立体構造の表面側がより親水性で、疎水性の部分は内側にあるべきタンパク質が、おそらく親水性の部分が内側に、疎水性の部分が外側に出ようとするので、立体構...続きを読む

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参考URL:http://yonepro.dot.ne.jp/works.html#work_08


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