【先着1,000名様!】1,000円分をプレゼント!

ABI310でシークエンスをしています。キットはBigDye terminater ver.3.1です。解析ソフトはsequencing analysis 3.4.1です。

最近使い始めて、コントロールとして付属のプラスミドとプライマーでサンプルを作って装置にかけました。結果、波形はきれいに出たのですが、Tの波形が若干右にずれていて、テキストとしてみるとNがいくつも出てしまいます。
たとえば、ATGCという配列があったとすると、波形ではTが右にずれているため、AとTの間が通常より隙間が広く、TとGの間が狭く、テキストにするとANTGCとかANNCとかになってしまいます。

一応、DyeSet/primer settingとかinstrument fileとかをいじって見たんですが今度はGがずれたりして、キッチリとピークが並んでくれません。

どうすれば直るのでしょうか?よろしくお願いします

このQ&Aに関連する最新のQ&A

A 回答 (3件)

matrix fileや解析モジュールは間違いなくBD ver3.1用のものを使っていますか?ver 1.1用のでは合いません。

matrix fileは装置ごとに固有のものなので、BD ver 3.1 standerd kitを買って泳動して作らなければならないはずですが、それは済んでいますか?
    • good
    • 0
この回答へのお礼

実は装置とパソコンは譲り受けたもので、だいぶ使われていなかったもののようです。ですのでソフトのバージョンが古くてmatrix fileの種類も隣のラボのものより少なくて、それでかなという風にも思っていました。新しいmatrix fileの作り方もマニュアルに載っていたのですが、試薬がないので今の状態でなんとかならないかと思っていましたが、やはり適正なmatrix fileを作り直さなければいけないのかもしれませんね。どうもありがとうございました!

お礼日時:2007/09/27 17:43

波形のずれは、局所的ですか?それとも全ての箇所で同じくらいずつシフトしていますか?


全部同じくらいずつシフトしているのであれば、ソフトウェアでうまくベースコールができていないのだと思います。
私はほとんどSequencing Analysisを使わないので設定の仕方についてアドバイスできないのですが、どこか設定をいじることで綺麗に配置させることはできるようになるはずです。
    • good
    • 0
この回答へのお礼

ずれは全体的にですね。回答をくださった他の方の話でも、ソフトウェアの設定の問題でしょうとのことなので、そのあたりを調整してみます。ありがとうございました。

お礼日時:2007/09/27 17:46

初めましてこんにちは。


私は理学部卒です。

国立でなくて私立大学ですので
よろしくお願いします。

シーケンサーは、塩基配列を調べる機器です。
やはりABIがこの業界での標準です。
この機械で論文を書かないと信用されません。

メーカーとしても、利幅の大きい機械です。
質量分析装置も良く売れていますよ。
科学研究費でよく買われていますね。
一度ご検討してみられてはどうですか。

ネイチャーに載る可能性もぐんと近づきますよ。
    • good
    • 0

このQ&Aに関連する人気のQ&A

お探しのQ&Aが見つからない時は、教えて!gooで質問しましょう!

このQ&Aを見た人が検索しているワード

このQ&Aと関連する良く見られている質問

QDNAシークエンサーでの配列分析における,ピークの出方について

私は植物のゲノムDNA解析を行っています.
以下の操作を行っています.
1.ゲノムDNAのサンプル(RE未処理)をPCRし,目的バンドをQLA-quick gel Extraction Kit(GLAGEN)を用い,ゲル抽出する.
2.BIg Dye Tm terminator cycle sequencing kit ver.3.1を用いて,ABI PRISM TM 310 Genetic Analyzerで配列分析を行った.
(ここでは,アニーリング温度をPCRのときのアニーリング温度と同じ,1度高い,1度低いに設定しシークエンス反応を試した.)

ここからが質問です.
1.配列分析結果において出てきた波形が,さまざまな波形が重なっていて一つのきれいなピークが出ていない.
2.後半部の方が急にピークが出なくなっている.
です.
どのようにしたら改善できるでしょうか?
よろしくお願いします.

Aベストアンサー

#2です。
>現在使用している解析機のプロトコルによれば、データに関してはシグナル
>強度をピークポイント数として表しています。シグナル強度が高いものは値
>が最大1300程で表示されます。自分のシーケンスデータだと、300~500未
>満の値しか確認できませんでした。若干確認できるGの幾つかには、中途半
>端に1000前後のピークポイント数は確認できます(解析不能データなのであ
>てにはなりませんが)。
 
 ちょっと前に書いたばかりですが、シークエンスが読めないケースは主として3つあります。
1.シグナルが弱すぎる。
要するにものがないからと思われます。原因はエタ沈失敗、酵素失活、何かを入れ忘れ等々、多数。
2.シグナルが強すぎる。
シークエンサーには解析できるシグナル強度の上限があります。それを超えるとうまく解析出きません。このときはサンプルを希釈すればすぐはかれます。
3.シグナル強度は適正範囲。
この場合、シークエンス反応、エタ沈等問題ないはずで、普通は読めるはずです。読めないのは、波形がいくつか重なっているためと思われます。つまり、元のDNA にコンタミが多いあるいはシークエンスPCR反応時のプライマーの特異性が低い等が考えられます。

我々は、アップライドバイオシステムの310を用いています。シグナル強度は装置のコンピューターで波形データをプリントすると右上に書いてあります。310ですと、読めるシグナルの範囲は下限が100くらい、上限が1500~2000くらいです。
質問者さんの装置の上限下限が解りませんが、310と同じだとすると、300~500は(310なら)ばりばりに読めるはずの値です。ものは充分にあるわけで、エタ沈等での失敗ではないと思います。
考えられる対策は、1)サンプルDNAにコンタミが多いので、TAクローニングしてからシークエンスする、あるいは、2)おっしゃっているとおり、シークエンスPCRのアニーリング温度を上げてみる等があります。
私にはサンプルDNAにコンタミが一番怪しく思えます。質問者さんの教授殿がおっしゃられるとおりTAクローニングすれば読めるのじゃないですか。

#2です。
>現在使用している解析機のプロトコルによれば、データに関してはシグナル
>強度をピークポイント数として表しています。シグナル強度が高いものは値
>が最大1300程で表示されます。自分のシーケンスデータだと、300~500未
>満の値しか確認できませんでした。若干確認できるGの幾つかには、中途半
>端に1000前後のピークポイント数は確認できます(解析不能データなのであ
>てにはなりませんが)。
 
 ちょっと前に書いたばかりですが、シークエンスが読めないケースは主として3つあり...続きを読む


人気Q&Aランキング