化学のカテゴリーに同様の質問をさせて頂いたのですが、もしやカテゴリー違いなのでは、と思いこちらのカテゴリーにも質問させて頂きました。

質問は、タイトルどおりです。
コンピテントセルに蛍光性タンパク質ベクターを、ヒートショック法を用いて導入しました。
このヒートショック法の機構とかいったものについて語れる方、ご教授願いたいです。

また、今回原核細胞についてヒートショック法を行ったのですが、この方法は真核細胞には適用できませんよね?そこらへんの確認と、その理由をお教え願いたいです。

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A 回答 (2件)

大腸菌に対しての42℃のheat shockの原理は本当のところちゃんとわかっていないじゃないでしょうか。

plasmidを取り込むだけであれば、このショックは必要としません。37℃でやるヒトもいるぐらいです。
現在のようにコンピテンシーの高いコンピテントセルを作る方法論が確立されてからは、あまり重要視されていないステップかもしれません。
都市伝説に近いですが、マラリアだったか、何らかの菌は凍結保存すると休眠状態でプレートに撒いても生えてこないが、熱ショックをかけると増殖が開始するという実験方法から派生して凍結保存しているコンピテントセルにplasmidを取り込ませてから、熱をかけて刺激するという方法が採られているという説もあります。
文面から察するに温度をかけることでplasmidが取り込まれるのならば、真核培養細胞でも同様の方法はあり得るかという意味かと思いましたが、実際に大腸菌でもメンブレンをplasmidが通過するためにいろいろと工夫がなされています。どの細胞にも共通で使用される方法といえば、あえて言うなら電気穿孔法つまりエレクトロポレーション法でしょうか。
ご参考になれば幸いです。
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この回答へのお礼

回答ありがとうございます。

質問させて頂く前に、本とかネットとかで調べたのですが、なかなか原理とかいったものについて、見つけることができなかったものですから、今回質問させていただきました。

都市伝説ですか…。信じるかどうかは、僕次第…ですかね…。
熱をかけて刺激を与えると上手くいく、みたいな結果は色々見つけられたのですが、やっぱり原理となると、おまじないだとか、Dr_Hyperさんの仰るように都市伝説的なもの、というような記述をネットでちらほら見かけました。
なかなか、この方法に関して明確な原理を得ることは難しそうですね。けれども、とても参考になりました!
ありがとうございました。

お礼日時:2007/11/12 14:27

>ヒートショック法


塩化カルシウム法のことでしょうか?
ヒートショックが操作に含まれるトランスフォーメーションの方法として、
少なくとも塩化カルシウム法、Hanahan法、Inoue法、塩化ルビジウム法があります。

hsp(ヒートショックプロテイン)を誘導することで、コンピタントセルが受けているダメージの修復を行わせるという考え方はあります。
ただ、ヒートショックを与えることなくhspを誘導した場合に同じ現象が観察されるという報告は見たことがありませんので、hspがどこまで形質転換頻度の向上に関与しているのかは不明瞭です。

大腸菌の細胞膜のFLIP-FLAP運動を促進することで、プラスミドが取り込まれる頻度を上げるといっている人もいますが、
これについてもヒートショックを与えること無しにFLIP-FLAP運動を促進させた場合の報告は見たことがありません。

>この方法は真核細胞には適用できませんよね?
どの方法についてか分かりませんが、「いかなる真核生物であってもヒートショックが操作に含まれる方法を用いた場合の形質転換頻度が0である」という報告は読んだことがありません。
塩化カルシウムをトランスフェクションに用いるChe-Okayama法はあります。

この回答への補足

回答ありがとうございます。。

すいません、こちらの意図したことが上手く伝わっているかどうかわかりませんが、実験操作として踏んだ手順をお伝えしますね。

MIYDさんが仰った塩化カルシウム法、これはコンピテントセルの調製法の1つとして理解しておりますが、これで宜しいでしょうか?

今回の実験で行った方法は、そのコンピタントセルに外来遺伝子を導入する上で、[コンピタントセル+ベクター]溶液を、氷温に曝した後、42℃のウォーターバス中で加温(ここがヒートショックであると思うんですが…)して、[コンピタントセル+ベクター]溶液に急激な温度変化を与えて、セルにベクターを取り込ませる、というものでした。

ここで「42℃加温するとベクターがセルに取り込まれる」という現象について、なぜかっていうこと、その方法を真核細胞に対して用いて同様の結果をえることができるのか、またその理由について知りたかったのです。
すいません、上手く伝えられたかどうかわかりませんが、これで再度お教え願いたいです。

補足日時:2007/11/11 16:39
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 そして、この実験中に問題が発生しました。

 検体、一次抗体が同一であれば、どのような検出法を用いても染まり方は同じですよね??
 しかし検体、一次抗体等の条件が統一されているのにも関わらず、染まる細胞数や染まる細胞の部位が統一されません。

 検出法には、
 (1)【Alexa488標識二次抗体を用いた蛍光抗体法】
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 はじめまして。
 現在、私はマウス小腸の神経内分泌細胞に発現する【とある神経伝達物質(以後SやGと略)】を検出するべく、免疫組織化学的実験法(IHC)を複数種類検討しています。
 そして、この実験中に問題が発生しました。

 検体、一次抗体が同一であれば、どのような検出法を用いても染まり方は同じですよね??
 しかし検体、一次抗体等の条件が統一されているのにも関わらず、染まる細胞数や染まる細胞の部位が統一されません。

 検出法には、
 (1)【Alexa488標識二次抗体を用いた蛍光抗...続きを読む

Aベストアンサー

寝ぼけて書いたところもあるかもしれません。
そのため、読みづらくて申し訳ありませんでした。

>mRNAの発現局在について
よっぽど新規のものでないかぎり、論文でありますし。
ノーザンでも何でも発現場所が示してある論文等があるといいですね。

>検出感度について
(3)はペルオキシダーゼという酵素が基質と反応して色が出るので、
時間が経つにつれ反応がどんどん進む(限度はありますが)と
シグナルが増強されると思いませんか?
(1)(2)は、蛍光物質がついても光るだけで増強はありません
(蛍光物質が沢山つくように工夫はされているシステムですが)。
ということと、経験上から(3)>(2)>(1)とあげました。
今、ふと思ったのですが、同じ数の蛍光物質があるとして、
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顕微鏡の性能によるところもありますが・・・
ことによると(2)>(1)ではなく(1)>(2)になるかもしれません。
質問者さんのそれぞれの方法で行った実験のシグナルがどのように見えているのか、
全くわからないので可能性で申し上げますが、Alexa488の像を暗くしたとこを想像するとCy3の像に見えるかも
ということなら、そういうことかもしれません。

参考までに。

寝ぼけて書いたところもあるかもしれません。
そのため、読みづらくて申し訳ありませんでした。

>mRNAの発現局在について
よっぽど新規のものでないかぎり、論文でありますし。
ノーザンでも何でも発現場所が示してある論文等があるといいですね。

>検出感度について
(3)はペルオキシダーゼという酵素が基質と反応して色が出るので、
時間が経つにつれ反応がどんどん進む(限度はありますが)と
シグナルが増強されると思いませんか?
(1)(2)は、蛍光物質がついても光るだけで増強はあり...続きを読む

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また、看護学生がバイタルを測るときに困る患者さんはどんな人なのでしょうか?その場合の対処方法も教えて下さい!!

Aベストアンサー

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とりあえず、おおよその値を図ってドクターに報告します。
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どうしても腕で測れない場合は、足首で測る時もあります。
血圧計の置く位置は、置ける場所に置く他無いので、出来るだけ患者さんに当らない位置のけば良いと思います。(頭の近くはNG)

困る患者さんは。
1.暴れる
2.不穏がる患者さん(暴れる可能性あり)
3.体を触ろうとする患者さん
4.理解力に難のある患者さん。
例えば、認知症の方など(注射と勘違いしてこぶしを握り締めたりする)

対処法
患者さんに説明を丁寧にするしかないでしょう。
無理だと思ったときは躊躇わずに先輩や指導者の指示を仰ぐ。

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それはどんなに小さい動物でも、血を持っている生き物なら全部に血液型があるんでしょうか?
もしある場合、動物は人と違ってあまり輸血する必要ってないと思うのですが、動物に血液型が必要な理由って何でしょうか?

ご回答よろしくお願いします。

Aベストアンサー

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ひょっとしたら血液型がない動物がいるかもしれません。しかしそれがいたからといって特にどうということもないので、わざわざ探す人もいないようです。
ちなみに犬猫の場合は血液型が合っていても輸血で急性反応がでてしまうことがあるので、必ず双方の血液を混ぜて反応を見て安全を確かめてから輸血します。クロスマッチ試験と言いますが、逆にこのため、血液型をあまり重要視しない人もいます。血液型がどうであれ結局一度血液を混ぜて試験しないといけないからです。
血液型は特に必要があって出てきたというよりも単に多様性の表出であろうと思われます。特定の疾患に強い血液型もありますが。

参考URL:http://www5a.biglobe.ne.jp/~wantail/aigo/blood.html


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