【復活求む!】惜しくも解散してしまったバンド|J-ROCK編

SDS-PAGEでゲルを作製するとき、分離ゲルに蒸留水を重層します。しかし、かなりそっと重層しても分離ゲルと蒸留水が混ざってしまい、ゲルが硬化した後に界面が凹凸のある状態に乱れています。蒸留水を重層するとき、何かよい方法はないでしょうか?また、蒸留水は必ず重層しないといけないのでしょうか?蒸留水を重層しなくても大丈夫なら、重層せずに、分離ゲルが固まった後に濃縮ゲルを重ねようと考えているのですが…?

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mlと?の違い」に関するQ&A: ml と ccの違いは?

A 回答 (3件)

アクリルアミドは酸素があると重合が阻害されますし、結局泡なんかで表面が乱れるので重層した方がいいと思います。



改善の余地としては、例えば分離ゲル溶液に~10%程度になるようにグリセロールを入れると比重の違いにより混ざり合いにくくなります。

もしくは、水より比重の軽い溶媒を重層する方法があります。例えば、水で飽和させた1-ブタノールなど。
具体的には50mlのチューブなどに、水とブタノールを半分ずつ位加えてシェイクし静置、ブタノールは上層、水は下層に分離するので上層を使用してください。

どちらか一方でかなり改善されると思いますので、楽そうな方をお試しください。
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この回答へのお礼

回答ありがとうございます。蒸留水は重層しないといけないんですね。教えていただいた方法についても試してみようと思います。

お礼日時:2008/02/05 05:25

私は200μLのピペットマンなどでゲル板を伝わらせて、重層していますが、特に乱れたことはありません。


以前、重層した直後に、ゲルをシーソーのように揺らしていたことがあったのですが(先輩の教えで)、その時はたまに界面が乱れていました。その後、重層した後には一切ゲル板にさわらないようにしてからは、界面が乱れたことはありませんよ。

TEMEDやAPSの濃度は適量ですか?
ちなみに、ストーブやドライヤーで暖めて早く固まらせようとすると界面が噴火します(しました)。

うまく行くと良いですね。
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この回答へのお礼

回答ありがとうございます。一般的に界面が乱れないのであれば、私のやり方に問題があると思うので、問題点を探ってみます。

お礼日時:2008/02/05 05:22

補足です。



グリセロールは基本的に泳動には影響を与えないので安心して使用できます。
(小さいタンパク質を分離する際に、ゲル内での拡散を抑えるために加えることもあります。)

ブタノールを試す場合は、濃縮ゲル溶液を注ぐ前にブタノールを除き、さらに水か泳動バッファーで分離ゲル上端を軽く洗ってください。
ブタノールが残っていると、濃縮ゲルがきれいに固まらないことがあります。
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この回答へのお礼

詳しい補足ありがとうございました。

お礼日時:2008/02/05 05:26

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Aベストアンサー

定電圧設定:発生する電流は徐々に低下する。熱発生も抑えられる。再現性が得やすい。泳動時間が長い。

定電流設定:電圧が徐々に上昇する。発熱量が増加する。再現性が難しい。泳動時間が短い。場合によってはゲル板が割れることもある。

結果に関して:
定電圧: 高分子側の移動が早い。低分子側の移動が遅い。
定電流: 上記の逆。

 どちらも、一長一短で、使用する泳動槽、扱うタンパク質によって、これらを使い分けるのが賢明かと思います。

(参考:電気泳動なるほQ&A 大藤道衛 編 羊土社)

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Aベストアンサー

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2層に分かれるのに時間がかかるので、一晩放置するという意見も見かけたのですが、この場合せっかく出来た水飽和ブタノールから水が抜け出る事が心配です。
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Aベストアンサー

>水+ブタノールを混ぜ、一晩放置したとしても、完全に水飽和しているブタノールと水に分かれるだけで、問題はないと言う事でしょうか?

そういうことですね。
正確には水で飽和されたブタノール層とブタノールで飽和した水層に別れるということですが。
それに完全に分離していない場合
とる場所によっては飽和ではないかもしれません。
(ただ実験に支障が出るほど異なるとは思えませんが)
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そうすると水の含量が減った水飽和ではないブタノールになっていくと思います。

QSDS-PAGE ゲルの作製について

running gel を固めている最中に、ゲル板とゲルの間に気泡が入ってしまいます。以前はこのような症状がなかったのですが、8月に入ってから何度作製しても、気泡が入ってしまうようになりました。

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宜しくお願いします。

Aベストアンサー

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QSDS電気泳動について教えて下さい。

SDS電気泳動ってどういうものなのでしょうか?
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Aベストアンサー

まず、SDS電気泳動(多くの場合はSDS-PAGE, SDS-polyacrylamide gel electrophoresisと言います)をやる目的ですが、タンパク質をサイズの違いで分離する方法です。例えば、細胞の中にはかなりの種類のタンパク質があるため、何かの方法で分離して検出する必要があります。SDS-PAGEでは、この分離を「タンパク質のサイズ(タンパク質の長さ)の違い」で行います。

SDS-PAGEの原理ですが、
1.タンパク質をSDSで変性させる(タンパク質の立体構造が壊れる)
2.電気泳動でタンパク質をポリアクリルアミドゲルの「網目」を通過させる(大きいサイズほど流れにくく、小さいサイズのタンパク質は流れやすい)
というものです。網目を通過しやすいかしにくいかでタンパク質の長さを測定します。結果として、ゲルの下の方には小さいタンパク質が、上の方には大きいタンパク質がきます。

SDSで変性させる理由ですが、タンパク質を直鎖状にすることです。タンパク質はその機能を発揮するために特有の立体構造(疎水結合やジスルフィド結合などを利用して)を形成します。タンパク質をそのまま泳動すると、ポリアクリルアミドゲルの「網目の通りやすさ」はタンパク質の長さだけに影響されず、タンパク質の形状(立体構造)にも影響を受けます。

SDS-PAGEを行う場合の多くは、タンパク質の長さだけを知りたいので、タンパク質の立体構造に影響される電気泳動は望ましくありません。そこで、SDSでタンパク質を直鎖状にして電気泳動します。

では、SDSをいれるとなぜ、タンパク質が直鎖状になるか、です。SDSは親水基と疎水基の両方をもつ化合物です。そして、その親水基は負(マイナス)に荷電しています。

タンパク質の立体構造はアミノ酸残基(アラニン、グリシン、リジン、トリプトファン・・・)の性質(特にアミノ酸残基がもつ電荷)の影響を大きく受けます。SDSがタンパク質に作用すると、SDSの疎水基側がタンパク質に親水基側が溶媒側に結合します。このタンパク質に結合したSDSの親水基(マイナスに荷電)がタンパク質を構成する様々なアミノ酸の特性を打ち消してしまいます。結果として、SDSが結合したタンパク質はアミノ酸残基の影響をうけられなくなり直鎖状になります。

また、このようにSDSが結合したタンパク質はマイナスに荷電しますので、電気泳動をするとタンパク質(とSDSの複合体)はマイナスからプラスの方へ泳動されていきます。

最後に、立体構造に大きな影響を与えるジスルフィド結合に関してです。このジスルフィド結合はSDSによって壊されません。そこで、多くのSDS-PAGEを行う場合は、SDSと共に2-mercaptoethanolやDTTといったジスルフィド結合を壊す還元剤で処理したタンパク質を電気泳動します。

なお、立体構造も含めて解析したい場合は、Native PAGEと呼ばれる方法で電気泳動を行います。

まず、SDS電気泳動(多くの場合はSDS-PAGE, SDS-polyacrylamide gel electrophoresisと言います)をやる目的ですが、タンパク質をサイズの違いで分離する方法です。例えば、細胞の中にはかなりの種類のタンパク質があるため、何かの方法で分離して検出する必要があります。SDS-PAGEでは、この分離を「タンパク質のサイズ(タンパク質の長さ)の違い」で行います。

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Q電気泳動

先日ゲル電気泳動(SDS-PAGE)をやった時にできたバンドで若干広がって出てきました

そこである人はブロードしてるね、といって

またある人はブロードニングしてるね、といって

またある人はスメアになってるね、と言いました

人によって言うことがまちまちなのですが、どういう意味なのか教えてください。お願いします

Aベストアンサー

ブロードとブロードニングは同じだと思いますが
両方とも泳動に対して水平方向に広がっている、という意味です。
両端が上がっている場合はスマイリング(Smiling)とも言います。
サンプルの精製を良くする、泳動bufferの組成を検討することで解消します。
タンパク質のPAGEなどで脱塩が不十分だったり、pHがあっていないと泳動が乱れブロードになることがあります。

一方、スメアは意味が全く違います。
通常1本のバンドとして確認するはずのものが、
分解による断片化などで尾を引くように縦方向に広がり、
一本に見えなくなる現象です。
サンプル調整の段階で泳動した物質の消化酵素のコンタミなどが考えられます。
Total RNAの抽出の際にRNaseがコンタミして断片化したりすると、
泳動でスメアになることがあります。

もともと複数本のバンドがでる場合は、ラダー(ladder;はしご)と表現します。
ラダーではあっても、1本ずつのバンドははっきり見えるはずです。
ラダーでありかつスメアな場合もあるわけです。
ラダーの例としてはPCR増幅したDNAがノンスペシフィックな増幅がかかっており、複数本のバンドが見えるような場合につかったりします。

それぞれ似た様な言葉ですがさしている現象は違いますし、
対処法、原因も違います。
使い分けてください。

SDS-PAGEに関してはGEのハンドブックが参考になります。
http://www.gelifesciences.co.jp/catalog/web_catalog.asp?frame5_Value=1009
この頃は有料になりましたが。

ブロードとブロードニングは同じだと思いますが
両方とも泳動に対して水平方向に広がっている、という意味です。
両端が上がっている場合はスマイリング(Smiling)とも言います。
サンプルの精製を良くする、泳動bufferの組成を検討することで解消します。
タンパク質のPAGEなどで脱塩が不十分だったり、pHがあっていないと泳動が乱れブロードになることがあります。

一方、スメアは意味が全く違います。
通常1本のバンドとして確認するはずのものが、
分解による断片化などで尾を引くように縦方向に広が...続きを読む

Q脱イオン水、MilliQ、蒸留水 の違いを教えて下さい

こんにちは。お世話になります。

バイオ、生化学系の実験に従事しているものですが「水」について教えて下さい。

水道水、脱イオン水、MilliQ、蒸留水(二段蒸留水)、超純水の違いを教えて下さい。
お互いの関係などありましたら(○○を~すると△△になる等)教えていただけると
わかりやすいかもしれません。

また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?

よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は除けません。

蒸留法は水を蒸留することで不純物を除く方法です。イオン交換法と組み合わせて2回蒸留することが一般的です。一般的な2次蒸留水の比抵抗は数MΩ・cmでバイオ・生化学関係には十分な純度です。動物培養細胞にも使用可能です。エンドトキシンも完全にフリーとまではいかないけれどもある程度の除去はできています。蒸留法は多くの不純物を除去可能ですが100度付近の沸点を持つ物質は除けません。

逆浸透法は半透膜に圧力をかけて精製する方法です。

限外濾過法は限外濾過膜を通す方法です。孔径は半透膜が数十nmに対し、限外濾過膜は数nmです。それゆえ、数kDa以上の分子であれば、限外濾過法で除けますので、エンドトキシンやRNaseなども除去できます。本当にエンドトキシンフリーな水が必要でしたら限外濾過法を行った水が必須です。ただ、普通のCOSとかHEKとかの動物細胞培養でしたら2次蒸留水でも十分です。蛍光検出用のマイクロアレイなんかは限外濾過水が必須なようです。

超純水は十数MΩ・cmの水のことです。MilliQはミリポア社の超純水装置を用いて作った水で比抵抗は15MΩ・cm以上と高純度の水です。MilliQに関してはイオン交換樹脂を通し、逆浸透法、限外濾過法を用いて精製しているようです。

>また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
これに関しては上で書いたように限外濾過膜で精製した水です。MilliQが当てはまるでしょう。(超純水も一般的には限外濾過をしているのでこれも当てはまりますかね。)

>動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?
これは、2次蒸留水以上の純度があれば十分です。2次蒸留水、MilliQ水、超純水が使用できます。

ただ、水関係の装置は日頃のメンテナンスが重要でイオン交換樹脂とか水を貯めるタンク、蛇口に汚染がないかは確認する必要があります。

実験書には必ずはじめのほうに書いてあることですので、pinokoBBさん自身でなにか実験書をご参照ください。

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は...続きを読む

Qサンプルバッファー

以前たんぱく質の実験をしたときに、SDS-PAGEを行う前にたんぱく質にサンプルバッファーを加えました。その後、サンプルバッファーで処理したたんぱく質を100℃で処理するのはなぜなのでしょうか?

Aベストアンサー

サンプルBufferには恐らく、色素(泳動のトレース用)、糖類(比重を上げるため)、還元剤(メルカプトエタノールかジチオスレイトールなど)、SDSが入っているはずです。

加熱することによりタンパク質を変性させて構造を壊してやり、SDSが全体に付着する、還元剤が全てのS-S結合に行き渡って還元が完全に行われるという効果があります。

Qエクセル STDEVとSTDEVPの違い

エクセルの統計関数で標準偏差を求める時、STDEVとSTDEVPがあります。両者の違いが良くわかりません。
宜しかったら、恐縮ですが、以下の具体例で、『噛み砕いて』教えて下さい。
(例)
セルA1~A13に1~13の数字を入力、平均値=7、STDEVでは3.89444、STDEVPでは3.741657となります。
また、平均値7と各数字の差を取り、それを2乗し、総和を取る(182)、これをデータの個数13で割る(14)、この平方根を取ると3.741657となります。
では、STDEVとSTDEVPの違いは何なのでしょうか?統計のことは疎く、お手数ですが、サルにもわかるようご教授頂きたく、お願い致します。

Aベストアンサー

データが母集団そのものからとったか、標本データかで違います。また母集団そのものだったとしても(例えばクラス全員というような)、その背景にさらならる母集団(例えば学年全体)を想定して比較するような時もありますので、その場合は標本となります。
で標本データの時はSTDEVを使って、母集団の時はSTDEVPをつかうことになります。
公式の違いは分母がn-1(STDEV)かn(STDEVP)かの違いしかありません。まぁ感覚的に理解するなら、分母がn-1になるということはそれだけ結果が大きくなるわけで、つまりそれだけのりしろを多くもって推測に当たるというようなことになります。
AとBの違いがあるかないかという推測をする時、通常は標本同士の検証になるわけですので、偏差を余裕をもってわざとちょっと大きめに見るということで、それだけ確証の度合いを上げるというわけです。

Q吸光度の単位

吸光度の単位は何でしょうか!?
一般的には単位はつけていないように思われるのですが。。
宜しくお願いします。

Aベストアンサー

物理的には、No.1さんも書かれているように吸光度も透過度も基本的に同じ単位系の物理量どうしの「比」なので「無単位」です。しかし、無名数では他の物理量、特に透過度と区別が付かないので、透過度は"透過率"として「%」を付けて表し、"吸光度"は「Abs(アブス)」を付けて呼ぶのが業界(分析機器工業会?)のならわしです。


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