論文を読んでいて分からなかったことがあります。
是非教えてください。

スクロース濃度勾配で遠心する方法があったのですが、スクロースの濃度勾配はどのようにつくるのでしょうか。イメージが全くわきません。よろしくお願いします。

それと、タンパク質をスクロース濃度勾配で遠心した結果をみるとサブユニットに分かれていたのですが、タンパク質を遠心するとサブユニットに分かれるものなのでしょうか。そもそも、どのような条件下でサブユニットがタンパクを形成したり、タンパクがサブユニットにばらばらになったりするのか分かりません。

基本がなってないので、まぬけな質問かもしれませんが、よろしくお願いします。

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A 回答 (3件)

>スクロースの濃度勾配はどのようにつくるのでしょうか。



gradient former を使うのが古典的かつ一般的です。gradient formerを言葉だけで説明しても理解しにくいかもしれませんが(何かで調べてみてください)、

二つのリザーバ(アクリル製の円筒がよく使われます)の底ぎりぎりの壁に小さな穴を開けて細いチューブでつなぎます。一方のリザーバには液の引き出し用の穴を同じようにあけてチューブをつなぎます。

引き出し側のリザーバに濃度の高いショ糖液、もう一方に濃度の低いショ糖液を入れます。引き出し側のリザーバをスターラで攪拌しながら、引き出し管からペリスタティックポンプでゆっくりと送液し、遠心管に注入します。最初は濃い液だけが引き出されますが、濃い液が減るにつれ、薄い液が移動してくるので、次第に引き出される液の濃度が下がって行きます。これで、遠心管の底の方が濃度が濃く、上に行くほど濃度が薄い濃度勾配ができます。

簡便法もいろいろ考案されていて、遠心管の底のほうに濃いショ糖液を少し入れて凍らせて、次にちょっと薄い液を少し入れて凍らせる、ということ繰り返して5段階くらいの濃度のショ糖液の氷の層を作り、これをゆっくり解かすことによって濃度勾配を作るという方法もあります。また、単にある濃度のショ糖液を遠心管に入れておいて凍結して、これをゆっくり解かすと、最初に解け出してくる液は濃いショ糖を含み、後になるほどショ糖が薄くなるので濃度勾配ができるという方法もあります。

>タンパク質を遠心するとサブユニットに分かれるものなのでしょうか。

遠心力自体でサブユニットに解離するということではないでしょう。
バッファー条件(塩濃度、pHなど)の変化、還元によるS-S結合の切断、グアニジンや尿素などの変性剤あるいは界面活性剤の添加、金属イオンなどの補因子のキレート除去、などなど、目的のタンパク質の性質よっていろいろな方法がとられると思います。
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密度勾配遠心法では、あらかじめ濃度勾配を形成させておいたショ糖または塩化セシウムの入ったチューブに試料を入れて遠心すると、その試料の比重に従って分散する、と学びましたが、この原理を教えてください。ショ糖が水分子を吸収しやすいことと関係があるのでしょうか?
また、塩化セシウムとショ糖をどのように使い分けるのかについても教えていただきたいです。よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

生物カテの方が専門家がたくさんいらっしゃるので適切ですが、ごく簡単に骨組みだけ、↓
http://www.ambis.co.jp/glossary/2007/01/densitygradient_centrifugation.html
セシウム塩はショ糖に比べ密度が高いので、上記記述のように容易に勾配を作れます。
細かいことについて、質疑応答がある以下のページも参考になります、↓(速度法から分子量を出すときには沈降係数と拡散係数を求めて、それからSvedberg の式を使って分子量を計算します…)
http://www.farisaka.bio.titech.ac.jp/aucforum/2002-11.pdf

Q百分率を表すこの3つ、W/V%、W/W%、V/V%…

はじめまして、お世話になります。

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どれも計算方法が同じなら、細かな意味まで覚えない良いような気がしますが^^;この場合W=質量 Vは体積でなない…?

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よろしくお願い致しますTwT

Aベストアンサー

こんにちは。WとVはそれでいいのではないでしょうか。

W/V%は、
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溶液100ミリリットル中に溶質が何ミリリットル入ってるか。

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QW/V%とは?

オキシドールの成分に 過酸化水素(H2O2)2.5~3.5W/V%含有と記載されています。W/V%の意味が分かりません。W%なら重量パーセント、V%なら体積パーセントだと思いますがW/V%はどのような割合を示すのでしょうか。どなたか教えていただけないでしょうか。よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

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Qエクセル STDEVとSTDEVPの違い

エクセルの統計関数で標準偏差を求める時、STDEVとSTDEVPがあります。両者の違いが良くわかりません。
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(例)
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Aベストアンサー

データが母集団そのものからとったか、標本データかで違います。また母集団そのものだったとしても(例えばクラス全員というような)、その背景にさらならる母集団(例えば学年全体)を想定して比較するような時もありますので、その場合は標本となります。
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QCell LineとPrimary Cellの違い

こんにちは。細胞培養の初心者です。
素朴な疑問があります。

例えば、同じRatの骨芽細胞でも、
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動物を解剖し、細胞を分離して得た初代培養細胞は、一般的に株化細胞に比べて増殖が遅く、培養を続けると脱分化するなど、培養を維持するのが難しいです。しかしながら、正常性が高く元の臓器と類似した性質をもつという点で重要な位置を占めています。
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実験内容によっては、株化細胞のほうが刺激に対するレスポンスが高く、きれいな結果が出ることが多いことから株化細胞に飛びつきがちになりますが、先ほどお話しした通り、実際の生体反応を反映している保障はできませんので、結果を客観的に見る必要があります。
つたない説明ですみません。ご参考になれば幸いです。

Qバッファー溶液に関する質問

PBSやHEPESといったバッファー溶液は単にpHが変わりくくするための溶液と考えて良いのでしょうか?
PBSやHEPESなどいくつかの種類があるようなのですが、
どうやって使い分けをすれば良いのでしょうか?
よろしくお願い致します。

Aベストアンサー

“PBSやHEPESといったバッファー溶液は単にpHが変わりくくするための溶液”かどうか解りませんが、“バッファーはpHを変わりくくするための溶液”です。酵素反応などの時に使用します。
 PBSは緩衝液というより生理食塩水の方に使う時の比重があると思いますので、リン酸緩衝液として話します(生理食塩水は、PBSの他トリス緩衝生理食塩水とかとかHEPES緩衝生理食塩水とかいろいろ用いられてます)。
中性付近に緩衝作用のあるものとしてリン酸とトリス(Tris(hydroxymethyl)aminomethan)が有ります。他にはGoodらが中性付近に緩衝作用があって、生化学の実験に使える物として発表した、HEPESとかMOPSとかのいわゆるグッドバッファーがあります。
 これらバッファーのどれを使うかというは、私は論文に書いてあったからそれをまねすると言うのが多いです。あまり自分ではどれにしようなどと考えませんが、考えた時に参考にする各緩衝液の特徴を簡単に書きます。ただ、私は物理化学苦手ですのでおかしな所が有るかもしれません。

リン酸バッファー、良い緩衝液だが、使いにくい時が多い。かならずしも使えないと言うわけではないが、例えばカイネースやフォスファターゼの反応をする時、ATP等の核酸を使用する時、あとリン酸化タンパク質等を使う時にも少し大丈夫かどうか考えるでしょうね。それから、カルシウムイオンやマグネシウムイオンが含まれる時、リン酸は配位結合を作りやすいのでそれに対する注意が必要といろいろややこしいことが多い。それで、トリスとかグッドバッファーなどが考案されたわけです。リン酸緩衝液は温度が変化してもpHがあまり変化しない(pH標準液に使用されている理由)ので、温度変化を伴う実験の時には有用。希釈するとpHが変わるので多少使いにくい。
トリス、一番生化学で多用される緩衝液。細胞毒性が高いので、培養細胞に用いられることはない。温度が変化するとpHが結構変化するので、温度変化を伴う実験には不向き。希釈してもほとんど変わらないので、濃いのを作っておいて希釈して使えるので便利。
HEPES、使えるpHはトリスと大体重なる(少しこちらが低い)が、値段がトリスに比べてべらぼうに高い(たいていのグッドバッファーは高い)のでトリスを使えない時に使用する。細胞毒性が低いので培養細胞の培地に入れて使われることが多い。CO2だけに緩衝作用を頼るものよりHEPESも入れることでpH変化はだいぶ少なくなる。例えば、クリーンベンチなどで作業する時。CO2だけだとあっという間にCO2が抜けて、培地がまっかっかになるがHEPES入りのもは結構耐えてくれる。温度変化に対するpH変化は、リン酸より少し大きいがトリスよりはだいぶ小さい。希釈に対しては強い。

“PBSやHEPESといったバッファー溶液は単にpHが変わりくくするための溶液”かどうか解りませんが、“バッファーはpHを変わりくくするための溶液”です。酵素反応などの時に使用します。
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Qエタノール沈殿での70%エタノールと100%エタノールの使い分け

エタノール沈殿をする際に、「70%エタノール」と「100%エタノール」を使用しますが、どうしてこの2種類の違う濃度のエタノールを使用するのか単純に疑問に思っています。
別に70%エタノールで洗浄して、もう一度70%エタノールで洗浄してもいいと思いますし、逆に両方とも100%エタノールでもいいのではないかと素人の私は思ってしまいます。
70%エタノールと100%エタノールを使い分ける意味を知っている方がおられましたら、お暇な時で結構ですので教えて頂ければ幸いです。
よろしくお願い致します。

Aベストアンサー

エタノール沈殿の原理は省いて簡単に書きます。

DNAが塩析してくる最適なエタノール濃度が70%ほどであるのです。
通常、100%エタノールをもとの液の2~2.5倍ほど加えると思います。
すると最終的にエタノールの濃度は70%ほどになるはずです。

このように最終的に70%ほどの濃度にする、ということが目的なので
最初に加えるエタノールは100%じゃないとかなり面倒なことになると思いませんか?

そして洗浄のときですが、70%エタノールではDNAは溶けません。
もちろん100%エタノールにも溶けません。

ですが、エタノール沈殿における「洗浄」というのは、余計な塩を取り除くということです。
塩は水に溶けますが、アルコールには溶けません。
なんで、洗浄の時に100%エタノールを使っても塩を溶かし込んで覗けないということになります。
70%エタノールの30%は水であるということが重要なのです。
30%の水に塩を溶かして洗浄すると想像してください。

簡単なエタノール沈殿ですが、それぞれに意味があり、かつよく考えれられてデザインさているのです。

そういうことをきちんと理解して実験することは重要だと思います。

エタノール沈殿の原理は省いて簡単に書きます。

DNAが塩析してくる最適なエタノール濃度が70%ほどであるのです。
通常、100%エタノールをもとの液の2~2.5倍ほど加えると思います。
すると最終的にエタノールの濃度は70%ほどになるはずです。

このように最終的に70%ほどの濃度にする、ということが目的なので
最初に加えるエタノールは100%じゃないとかなり面倒なことになると思いませんか?

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もちろん100%エタノールにも溶けま...続きを読む

Q遺伝子改変マウスについて

趣味で生物学を勉強している者です。最近は様々な遺伝子を潰したり入れたりしているマウスがあるようですが、その名称で混乱している部分があるので質問させていただきます。ノックアウトマウスは特定の遺伝子を欠損させているというのは理解できますが、その逆のノックインマウスとトランスジェニックマウスは両者にどのような違いがあるのでしょうか?

よろしくおねがいします。

Aベストアンサー

トランスジェニック(遺伝子導入)は、文字通りある生物のゲノムに(染色体に組み込まれたかたちで)、人為的に外来の遺伝子を導入したものです。ですから、ノックアウトにせよノックインにせよ、トランスジェニックの一種です。組み換えDNA実験の法令のなかでも、すべて遺伝子導入生物として扱われます。

実際の現場では、トランスジェニックは、特に外来の遺伝子を染色体上の不特定の場所に挿入させることをさします。たとえば、ある変異の原因遺伝子がこれであるということを証明するために、正常な遺伝子を導入することで変異体の表現型が回復するかどうかを見るような場合に使います。マウスでは、受精卵にDNAを注射して、妊娠マウスに借り腹させて作成します。

ノックアウトは、ある遺伝子をつぶしたときにどういう異常が起こるかを見るために行われます。これは、狙った遺伝子と相同な配列を持ち、内部に遺伝子の機能を失わせるような欠失や挿入、あるいはストップコドンなどを導入したDNAを入れて、相同組み換えによってゲノム上の遺伝子と入れ替えることによって行います。うまく相同組み換えがおこる頻度は非常に低いので、受精卵に注射するのではなく、細胞培養実験のテクニックを利用して、多数の胚性幹細胞(ES cell)に、どばっとDNAを導入して、そのなかから、うまくいったものをスクリーニングするという方法がとられます。これを、別に採取した胚に移植して作成します。詳しいことは割愛します。

ノックインは、ノックアウトと同様に作成しますが、ゲノム上の遺伝子と入れ替える部分に、何か機能的な遺伝子を入れておくところが違います。たとえば、ある遺伝子の内部にGFP(クラゲ由来の蛍光たんぱく質)遺伝子を導入すると、その遺伝子の発現する場所や時期が、蛍光によってモニターできるようになります。最近では、ノックアウトを目的とする場合でも、発現の指標となるような遺伝子のノックインが同時にできるようにデザインすることが普通になってきました。

トランスジェニック(遺伝子導入)は、文字通りある生物のゲノムに(染色体に組み込まれたかたちで)、人為的に外来の遺伝子を導入したものです。ですから、ノックアウトにせよノックインにせよ、トランスジェニックの一種です。組み換えDNA実験の法令のなかでも、すべて遺伝子導入生物として扱われます。

実際の現場では、トランスジェニックは、特に外来の遺伝子を染色体上の不特定の場所に挿入させることをさします。たとえば、ある変異の原因遺伝子がこれであるということを証明するために、正常な遺伝子を...続きを読む

Qサテライトコロニー?について

こんばんは。
初めて質問します。よろしくお願いします。

大腸菌のトランスフォーメーション実験を行い、アンピシリンとX-gal染色によりセレクションしました。
白色コロニーをコロニーPCRにかけるために選ぶ際、指導者に、サテライトコロニー(?)は白色でも正しくトランスフォーメーションされていないことが多い、と言われました。
サテライトコロニーとは、1つの大きなコロニーのまわりに小さな飛び散ったようなコロニーが見えるもののことを指すらしいのですが。
なぜ、正しくトランスフォーメーションされていないのでしょうか?確かにコロニーPCRでは増幅されませんでした。
指導者はその理由は忘れてしまったそうです(-_-メ)
調べても中々わかりません。
どなたかご存知でしたら教えてください。
参考URLでもかまいません。
よろしくお願いします。

Aベストアンサー

サテライトコロニーは、形質転換体のコロニーによって、培地中の薬剤が分解されたために、形質転換されていない(つまり、プラスミドを持っていない)ものがコロニーを形成してしまう現象です。

プラスミド自体を持っていないので、β-ガラクトシダーゼ活性も持ちませんから、コロニーの色は白色となります。

ちなみに、サテライトコロニーは、アンピシリン耐性で選抜するときによく見られますが、アンピシリンの代わりにカルベニシリンという薬剤を使うと、サテライトコロニーの発生をかなり抑えられます。(カルベニシリンは、アンピシリンと比べるとかなり高価ですが。)

Qアンピシリンの失活温度について

アンピシリンの失活温度について教えてください。

LB(Amp)のプレート培地を作製する時にいつも思うことです。

オートクレーブ後の三角フラスコに入っているLB培地に、いつアンピシリンを添加すればいいのかわかりません。

僕の場合は、三角フラスコをクリーンベンチ内で両手で触って円を描くように揺らしてみて、手をつけてられる熱さまで冷ましてから入れるようにしています。

宜しくお願いします。

Aベストアンサー

私も学部生の頃に同じことを考えましたが。。。結論は結構微妙なところだと思います。アンピシリンは酵素のように高温になると変成していっぺんに失活する訳ではなく、高温になるほど分解の進みが早くなるわけですよね。(もちろん1時間くらい煮沸すればかなり失活するかもしれませんが。。)。というわけで、結局実験的にできるだけ影響が起きない(しかし、ゲルが固まらない)ような妥協点の温度でやるために手で触れる=約60℃で添加することがスタンダードになってるわけです。


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